發(fā)布時(shí)間：2018-06-28 17:43

  本文選題：肺炎鏈球菌 + 組氨酸激酶　； 參考：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2009年博士論文

【摘要】： 雙組份系統(tǒng)(two-component system, TCS)是存在于細(xì)菌內(nèi)的一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng),細(xì)菌通過感受外界環(huán)境變化、調(diào)控生存、毒力因子表達(dá)來維持自身生存,是細(xì)菌適應(yīng)選擇壓力的一種機(jī)制。在不同細(xì)菌中,該系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)非常類似,都由組氨酸激酶和反應(yīng)調(diào)節(jié)子組成。其中,組氨酸激酶具有激酶、磷酸轉(zhuǎn)移酶和磷酸酶的活性,是雙組份系統(tǒng)通路中的核心蛋白[1]。其機(jī)制是外界信號(hào)作用于組氨酸激酶的膜外配體結(jié)合域,使組氨酸發(fā)生自身磷酸化,并將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到反應(yīng)調(diào)節(jié)子上,而產(chǎn)生一系列的調(diào)控反應(yīng)[2]。由于在哺乳動(dòng)物(包括人類)中未發(fā)現(xiàn)類似的調(diào)控系統(tǒng)[3],因此,組氨酸激酶是研發(fā)新型抗菌藥物的潛在靶標(biāo)[4]。 組氨酸激酶VicK屬于Pho亞家族,其最初是在枯草芽孢桿菌中被鑒定[5]。肺炎鏈球菌中的VicR/K[6]也被命名為MicA/B[7]或YycF/G[8],是目前肺炎鏈球菌中已發(fā)現(xiàn)的13對TCS組份之一。該通路系統(tǒng)具有高保守性和低G+C含量的特點(diǎn),不僅影響肺炎鏈球菌的存活[9],還參與了其毒力、感受態(tài)的形成、以及維持菌體膜完整性等重要的作用[10]。因此,以肺炎鏈球菌組氨酸激酶VicK作為靶點(diǎn)有望篩選到有效的抗菌新藥。目前,已有針對枯草芽孢桿菌及表皮葡萄球菌的組氨酸激酶YycG的篩選并得到了一些有效的抑制劑的報(bào)道[11],而對肺炎鏈球菌的研究中國內(nèi)、外均未見相關(guān)報(bào)道。因此,本研究擬通過肺炎鏈球菌的組氨酸激酶VicK為研究對象,對其進(jìn)行同源模建后虛擬篩選出針對該靶點(diǎn)的肺炎鏈球菌的先導(dǎo)抑制劑并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。本研究內(nèi)容包括以下幾個(gè)部分: 1.肺炎鏈球菌組氨酸激酶VicK的同源模建與分析。 采用同源模建的的方法構(gòu)建VicK蛋白的三維結(jié)構(gòu),并用Procheck、profile_3D軟件對此結(jié)構(gòu)模型的合理性進(jìn)行驗(yàn)證,采用Gromacs軟件進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)優(yōu)化,取平衡階段的構(gòu)象作為虛擬篩選中的受體模型。用Autodock4.0軟件將結(jié)構(gòu)模型與底物ADP進(jìn)行自動(dòng)對接,分析二者之間的相互作用。結(jié)果顯示肺炎鏈球菌組氨酸激酶VicK與PDB編號(hào)為2c2a的Thermotoga maritima X晶體衍射結(jié)構(gòu)(分辨率1.9 ?,R因子0.247)具有33%的一致序列,57%相似性;VicK模建后的結(jié)構(gòu)與模板能很好的疊合;在活性口袋處的保守氨基酸殘Asn145、Asn149、Lys152以及口袋內(nèi)部的疏水殘基在結(jié)合、水解底物的過程中發(fā)揮重要作用。結(jié)果提示:模建的肺炎鏈球菌組氨酸激酶VicK達(dá)到了設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn),該模型可作為設(shè)計(jì)抗菌藥的研究起點(diǎn)。 2.肺炎鏈球菌組氨酸激酶VicK先導(dǎo)抑制劑的虛擬篩選。 將已知底物ADP疊合到模建的受體中,選擇受體中距離小分子4 ?內(nèi)的氨基酸殘基為活性口袋,首先采用DOCK4.0對SPECS小分子數(shù)據(jù)庫中的200,000個(gè)分子進(jìn)行初步篩選,選擇評分靠前的10,000個(gè)化合物;再用Sybyl6.8軟件包中的Cscore模塊進(jìn)行評分,獲得2,425個(gè)化合物;然后用類藥性分析篩選得到308個(gè)化合物;最后采用Autodock4.0及經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行人工挑選。結(jié)果顯示通過四輪不同的篩選策略,最終從SPECS小分子數(shù)據(jù)庫中得到了105個(gè)小分子化合物。 3.肺炎鏈球菌組氨酸激酶VicK活性鑒定。 經(jīng)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(http://smart.embl.de/smart/show_motif)對肺炎鏈球菌組氨酸激酶VicK分析,初步預(yù)測其由五個(gè)部分組成:一個(gè)跨膜信號(hào)肽,和4個(gè)已被證實(shí)的功能域:PAS、PAC、HisKA(HK)和ATPase_c。由于肺炎鏈球菌組氨酸激酶VicK是一個(gè)跨膜蛋白,因此需要對其胞內(nèi)的HATPase_c激酶功能域片段(VicK')進(jìn)行截短表達(dá)。PCR擴(kuò)增肺炎鏈球菌(D39) VicK胞內(nèi)激酶功能域序列,與pET28a載體構(gòu)建重組質(zhì)粒。之后,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3),經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),通過SDS-PAGE和Western Blot進(jìn)行鑒定,采用鎳離子層析柱對表達(dá)的目的蛋白進(jìn)行純化,最后采用熒光激酶檢測試劑盒檢測純化的VicK'蛋白的酶活性。結(jié)果顯示原核表達(dá)的VicK'蛋白大約為35kDa,其純度為95%,并具有水解ATP激酶的活性。 4.先導(dǎo)抑制劑的體外、體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。 利用表達(dá)的VicK'蛋白,初步對SPECS小分子化合物庫中虛擬篩選獲得的105個(gè)化合物進(jìn)行篩選,以此得到具有抑制酶蛋白水解ATP作用的小分子化合物;選擇對VicK'酶蛋白活性抑制率大于50%的23個(gè)化合物,進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn),最終得到6個(gè)有抑菌作用的小分子化合物。為了進(jìn)一步了解這6個(gè)化合物的抗菌特點(diǎn)及細(xì)胞毒性,分別采用了最小抑菌濃度(MIC)、最小殺菌濃度(MBC)以及細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。 選取這6個(gè)化合物的不同濃度檢測在不同的時(shí)間對肺炎鏈球菌作用的特點(diǎn)并繪制曲線,同時(shí),依據(jù)此曲線來估計(jì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的體內(nèi)用藥量及給藥時(shí)間。經(jīng)腹腔感染動(dòng)物摸索動(dòng)物的最低肺炎鏈球菌致死劑量,最終選取每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的細(xì)菌濃度為5×103 CFU/ml;選用青霉素為陽性對照建立肺炎鏈球菌感染后治療的動(dòng)物模型;隨后對此6個(gè)化合物進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn),并設(shè)立必要的陰性及陽性對照,每組10-12只。結(jié)果顯示,通過體外篩選得到6個(gè)具有抑菌作用的小分子化合物,其MIC的范圍在0.28μΜ-200μΜ之間;且抑菌效果隨著化合物濃度的增加而增強(qiáng)、抑菌的作用時(shí)間也延長,該結(jié)果表明這6個(gè)化合物抗菌作用具有明顯的時(shí)間、濃度依賴關(guān)系。通過生存分析(Kaplan-Meier法)顯示各組小鼠的生存時(shí)間總的比較中,化合物/藥物處理因素的作用明顯,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。配對比較發(fā)現(xiàn)化合物1-6都較陰性對照組有顯著的延長感染模型小鼠的存活時(shí)間(p0.01);但是化合物1、2、3和6的效果明顯差于陽性對照青霉素的治療效果(p0.05或p0.1);化合物4和5顯示了比較理想的治療效果。 上述結(jié)果提示,本研究針對靶點(diǎn)蛋白VicK虛擬篩選出的105個(gè)先導(dǎo)抑制劑中,經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證有6個(gè)具有抑制肺炎鏈球菌生長的小分子化合物,為進(jìn)一步研究抗菌的新型藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
[Abstract]:Two - component system ( TCS ) is a kind of signal transduction system which exists in bacteria . It is a mechanism for bacteria to adapt to the selection pressure . The mechanism is that external signals act on the extracellular ligand binding domain of histidine kinase to phosphorylate histidine itself and transfer phosphoric acid groups to the reaction regulator to produce a series of regulatory responses . Since similar regulatory systems are not found in mammals , including humans , the histidine kinase is a potential target for the development of novel antibacterial drugs .


Histidine kinase VicK belongs to the Pho subfamily , which was originally identified in Bacillus subtilis . In Streptococcus pneumoniae , VicR / K - 6 mutants were also named MicA / B.7 mutants or YycF / G mutants . It is one of the 13 TCS components found in Streptococcus pneumoniae . The pathway system has the characteristics of high conservative and low G + C content , which affects not only the survival of Streptococcus pneumoniae , but also its virulence , the formation of competent state , and the maintenance of cell membrane integrity . Therefore , it is possible to screen effective antibacterial drugs by using Streptococcus pneumoniae histidine kinase ( VicK ) as a target . At present , there are some effective inhibitors for the selection of histidine kinase YycG in Bacillus subtilis and S . S . , and no relevant reports have been reported in the study of S . pneumoniae . Therefore , we have studied the pilot inhibitor of Streptococcus pneumoniae by homologous modular construction and conducted an experimental study in the study of Streptococcus pneumoniae . The contents of this study include the following parts :


1 . Homology modeling and analysis of Streptococcus pneumoniae histidine kinase VicK .


The three - dimensional structure of VicK protein was constructed by using the method of homology modeling . The rationality of the structural model was verified by using the software of Procheck and profile _ 3D . The conformation of the structure was optimized by using the software of Gromacs . The results showed that the structure and template of Streptococcus pneumoniae histidine kinase VicK and PDB No . 2c2a had an important role in the process of binding and hydrolyzing the substrate . The results showed that the model of Streptococcus pneumoniae histidine kinase VicK reached the design standard , which could be used as the starting point of the study of antimicrobial agents .


2 . Virtual screening of Streptococcus pneumoniae histidine kinase VicK leader inhibitor .


The known substrate ADP is laminated to the die - built receptor , and the small molecule 4 is selected in the receptor . The amino acid residue in SPECS small molecule database was first screened by DOCK4.0 , then the score was selected by using the Cscore module in Sybyl6.8 software package , then 308 compounds were obtained by using the Cscore module in Sybyl6.8 software package .


3 . Identification of Streptococcus pneumoniae histidine kinase VicK activity .


coli BL21 ( DE3 ) was amplified by SDS - PAGE and Western Blot . The results showed that the prokaryotic expression of VicK ' protein was about 35 kDa , the purity was 95 % , and the activity of ATP kinase was hydrolyzed .


4 . In vitro and in vivo experimental verification of the pilot inhibitor .


In order to further understand the antibacterial characteristics and cytotoxicity of these six compounds , the minimum inhibitory concentration ( MIC ) , minimum bactericidal concentration ( MBC ) and cytotoxicity test were used to further understand the antibacterial characteristics and cytotoxicity of these six compounds .


The results showed that the effects of compound 1 - 6 on the survival time of mice were significantly longer than those in the negative control group ( p < 0.01 ) . The results showed that the compound 1 - 6 had significant difference in the therapeutic effect of the positive control penicillin ( p < 0.01 ) .


The results suggested that 6 small molecule compounds with inhibiting S . pneumoniae growth were verified by experiments , which provide experimental basis for further study of anti - bacterial drugs .
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R378

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本文編號(hào)：2078823