本文選題：mDia1 + PI3K��； 參考：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2008年博士論文

【摘要】： 背景和目的: 血小板為含顆粒無核盤狀細(xì)胞,凝血酶等激動(dòng)劑能夠誘發(fā)血小板表面整合素受體GPαⅡbβ3變構(gòu)活化(“inside-out”信號(hào)),使其對(duì)配體(主要是纖維蛋白原,Fg)親和力顯著增高,由此導(dǎo)致血小板在固化Fg表面的鋪展以及懸浮血小板的聚集,驅(qū)動(dòng)這種鋪展和聚集的動(dòng)力是Actin細(xì)胞骨架重構(gòu)。磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)在凝血酶誘導(dǎo)的GPαⅡbβ3變構(gòu)活化過程中發(fā)揮重要作用,但其在活化GPαⅡbβ3誘發(fā)的Actin細(xì)胞骨架重構(gòu)(“outside-in”信號(hào))過程中的作用尚不清楚。 mDia1(mammalian diaphanous)是黑腹果蠅翅膀中diaphanous蛋白的同源物,屬于Formin相關(guān)蛋白家族。其作為細(xì)胞骨架調(diào)控蛋白,主要參與調(diào)控細(xì)胞分裂、極化、運(yùn)動(dòng)、張力絲的形成及神經(jīng)突的生長(zhǎng)等細(xì)胞骨架重構(gòu)過程。mDia1作為小分子GTP酶RhoA的下游分子,通過與Actin結(jié)合蛋白profilin的相互作用參與調(diào)控Actin細(xì)胞骨架的重構(gòu)。mDia1是有核細(xì)胞中Actin細(xì)胞骨架重構(gòu)的主要調(diào)控蛋白,但其在血小板Actin細(xì)胞骨架調(diào)控中的作用尚不清楚。本課題通過分析mDia1在人源性血小板中的表達(dá)及亞細(xì)胞定位,以研究該蛋白在血小板鋪展和聚集等Actin細(xì)胞骨架重構(gòu)過程中的作用及PI3K對(duì)該調(diào)控過程的影響。 方法:①免疫熒光法檢測(cè)mDia1及F-actin在血小板中的表達(dá)及分布;②采用血小板聚集儀檢測(cè)Wortmannin和抗mDia1抗體導(dǎo)入對(duì)血小板聚集率的影響;③Western blot檢測(cè)mDia1在血小板靜止、鋪展及聚集過程中的表達(dá)及其與Actin細(xì)胞骨架的關(guān)系;④GST pull-down實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同狀態(tài)血小板內(nèi)小分子GTP酶RhoA、Rac1和Cdc42活性變化;⑤免疫共沉淀法檢測(cè)不同狀態(tài)血小板內(nèi)RhoA、Rac1和Cdc42與mDia1相互結(jié)合情況。 結(jié)果:①mDia1在靜止、凝血酶誘導(dǎo)的鋪展或聚集血小板內(nèi)表達(dá)總量沒有明顯差異;②在血小板不同鋪展程度下,mDia1與F-actin均呈共定位狀態(tài);③凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集過程中,mDia1從Triton-X100可溶性胞漿部分向Triton-X100不可溶性細(xì)胞骨架部分轉(zhuǎn)位;④抗mDia1抗體導(dǎo)入血小板后能夠抑制凝血酶誘導(dǎo)的血小板鋪展和聚集;⑤PI3K抑制劑Wortmannin能夠抑制血小板聚集,抑制mDia1從Triton-X100可溶性部分向Triton-X100不可溶性部分的轉(zhuǎn)位;⑥Wortmannin可抑制凝血酶誘導(dǎo)的血小板鋪展,表現(xiàn)為張力絲和片狀偽足形成及mDia1和F-actin共定位受阻;⑦凝血酶能夠誘導(dǎo)鋪展或聚集血小板中RhoA活性上調(diào),且活化態(tài)血小板中RhoA-GTP與mDia1相結(jié)合的量顯著增高,但是Wortmannin能夠阻斷由凝血酶引起的活化態(tài)血小板中RhoA活性上調(diào),并阻斷凝血酶引起的RhoA-GTP與mDia1的結(jié)合。⑧凝血酶雖能上調(diào)聚集血小板中Rac1和Cdc42的生物活性,但并未誘發(fā)其與mDia1結(jié)合,該過程也不能被Wortmannin阻斷。 結(jié)論:①RhoA-mDia1信號(hào)通路參與調(diào)控凝血酶誘導(dǎo)的血小板鋪展和聚集等Actin細(xì)胞骨架重構(gòu)過程;②PI3K為RhoA-mDia1信號(hào)通路的上游分子。
[Abstract]:Background and objective: platelets are granular seedless disc cells. Agonists such as thrombin can induce the platelet surface integrin receptor GP 偽 鈪，

本文編號(hào)：2069911