本文選題：ezrin + 蛋白網絡　； 參考：《南京醫(yī)科大學》2008年博士論文

【摘要】： 受精是一個新個體產生的標志,是指精子和卵子自發(fā)融合成為受精卵的過程,要完成這一過程必須具備一定的條件,精子獲能就是其中之一。獲能是指精子獲得使卵細胞受精的能力,是精子在自然狀態(tài)下完成受精過程的一個必需條件。哺乳動物的精子在受精前都要經歷獲能過程。在精子獲能過程中,對于精子質膜的修飾改變是這一過程的一個關鍵事件。但是迄今為止,對于這一重要事件分子機制的研究結果還不多,遠不能闡明這一過程。 Ezrin蛋白是ERM蛋白家族的成員之一,也是該家族中被研究最多的蛋白。在體細胞中的大量研究顯示,ezrin是細胞皮質骨架蛋白與細胞質膜固有膜蛋白之間的銜接蛋白,它的主要作用是通過對骨架蛋白與膜蛋白的銜接作用,引起細胞膜表面結構的重構,從而介導包括細胞黏附、變形、微絨毛形成等一系列的細胞事件。不僅如此,活化的ezrin還能夠和Rho解離抑制因子——RhoGDI一起促進細胞表層骨架蛋白的形成,從而使actin聚合形成F-actin。因此,在體細胞中就存在一個由ezrin、actin、RhoGDI、Rho蛋白以及質膜蛋白共同形成的蛋白網絡體系。這個蛋白網絡的主要作用就是對細胞膜的表面結構進行組裝。 本實驗室在前期研究工作中發(fā)現(xiàn),ezrin和RhoGDI1表達于人睪丸組織中,那么,會不會前述與ezrin相關的蛋白網絡體系也能在精子中發(fā)揮功能呢?因為在精子獲能過程中也存在膜重構的現(xiàn)象。我們推測,這個網絡體系可能作用于精子獲能過程中的膜重構。針對這一問題開展了以下研究:(1)用ERM家族磷酸化位點的抗體行不同獲能狀態(tài)精子蛋白的Western Blot實驗,結果顯示在精子獲能過程中,ezrin第567位蘇氨酸發(fā)生了磷酸化修飾,這說明ezrin在獲能過程中被活化。推測活化后的ezrin可以與下游一系列蛋白通過直接或間接相互作用參與膜的重構,故運用一系列免疫共沉淀試驗進行驗證。(2)用免疫共沉淀方法比較獲能前后ezrin與RhoGDI1相互作用情況,結果顯示,兩者的相互作用在獲能后增加;運用二維電泳結合銀染和磷酸化染色方法,結果顯示,RhoGDI1自身還在獲能過程中發(fā)生了磷酸化修飾,前述兩個結果均可導致RhoGDI1自Rho蛋白解離下來。對后者用免疫共沉淀的方法進行驗證,結果符合預想,RhoGDI1與RhoA的相互作用在獲能后減弱。這一結果提示RhoA可參與下游一系列通路導致F-actin形成。(3)對于這一系列事件的最終結果用F-actin特異性染料Texas Red-Phalloidin染色進行分析,結果顯示,獲能后,精子的F-actin染色尤其是頭部的染色明顯增強。說明獲能過程中actin聚合。(4)據(jù)體細胞中的研究,ezrin可以和F-actin相互作用,故運用Co-IP方法對ezrin和F-actin的相互作用進行分析,結果顯示獲能后ezrin與F-actin的相互作用增強。這與體細胞中的現(xiàn)象類似,因此我們推測ezrin還可通過其氨基端與膜相互作用。(5)篩選了一個精子膜蛋白cd44,同樣運用免疫共沉淀的方法比較其與ezrin相互作用情況,結果顯示,ezrin在獲能后與cd44相互作用增加,且ezrin不僅可以和cd44的未修飾形式相互作用,還可與其糖基化修飾形式相互作用。(6)最后,分析ezrin和actin在獲能中可能的功能,分別用ezrin和actin抗體對獲能和頂體反應進行阻斷,結果顯示,ezrin和actin抗體能夠阻斷精子獲能但對于頂體反應則沒有影響。 總之,本研究為人精子獲能分子機制提出了一個新的假說,即在人精子獲能過程中,ezrin、RhoGDI1、actin、RhoA及膜蛋白可以通過相互作用形成一個蛋白網絡體系,這樣的網絡可以調節(jié)獲能過程中精子質膜重組、精子膜蛋白的重新分布,從而促進精子與卵子的受精過程。
[Abstract]:Fertilization is a sign of a new individual, which refers to the spontaneous fusion of sperm and egg into a fertilized egg. In order to complete this process, a certain condition must be provided, and the capacitation of the sperm is one of them. The ability to acquire the sperm to fertilize the egg cells is a necessary condition for the sperm to complete the process of fertilization in its self state. Mammalian spermatozoa undergo the process of capacitation before fertilization. In the process of sperm capture, modification of the sperm plasma membrane is a key event in this process. But so far, the results of the molecular mechanism of this important event are not much, far from clarifying the process.
Ezrin protein is one of the members of the ERM protein family and is also the most studied protein in the family. A large number of studies in somatic cells show that ezrin is a cohesive protein between the cytoskeleton and the membrane propria of the cell membrane. Its main role is to induce the cell membrane surface through the cohesion of the skeleton egg white and membrane protein. The reconstruction of the surface structure mediates a series of cell events, including cell adhesion, deformation, and microvilli formation. Not only so, the activated ezrin can also promote the formation of the cytoskeleton protein with the Rho dissociation inhibitor, RhoGDI, so that actin is polymerized to form F-actin., so there is a ezrin, a in somatic cells. Ctin, RhoGDI, Rho protein and plasma membrane proteins co formed a protein network system. The main function of this protein network is to assemble the surface structure of the cell membrane.
In our previous study, we found that Ezrin and RhoGDI1 are expressed in human testicular tissue. Then, will the ezrin related protein network system also function in sperm, because membrane remodeling exists in the process of sperm capacitation. We speculate that this network system may play a role in the process of sperm capacitation. The following studies have been carried out in the following aspects: (1) the Western Blot experiment with the antibodies of the ERM family phosphorylation sites in different capacitated sperm proteins shows that the ezrin 567th threonine has phosphorylated modification during the process of sperm capacitation, which indicates that ezrin is activated during the capacitation process. The activated ezri is conjectured. N can participate in the reconstruction of membrane through direct or indirect interaction with a series of downstream proteins, so a series of immunoprecipitation tests are used to verify. (2) the interaction of Ezrin and RhoGDI1 before and after the immune coprecipitation is compared. The results show that the interaction between the two proteins is increased after the acquisition of energy; two dimensional electrophoresis combined with silver staining. And phosphorylation staining, the results showed that RhoGDI1 itself was also phosphorylated during the acquisition process. The previous two results could lead to the dissociation of RhoGDI1 from the Rho protein. The latter was verified by the immunoprecipitation method. The results agreed that the interaction between RhoGDI1 and RhoA weakened after the acquisition of energy. This result suggests RhoA. A series of downstream pathways may be involved in the formation of F-actin. (3) the final results of this series of events were analyzed with F-actin specific dye Texas Red-Phalloidin staining. The results showed that after the acquisition of energy, the staining of the sperm F-actin staining, especially on the head, was obviously enhanced. Ezrin can interact with F-actin, so Co-IP method is used to analyze the interaction between Ezrin and F-actin. The results show that the interaction between Ezrin and F-actin is enhanced after the acquisition of energy. This is similar to the phenomenon in somatic cells. Therefore, we speculate that ezrin can also interact with the membrane phase through its amino terminal. (5) a sperm membrane protein CD44 is screened. The interaction with ezrin was compared with the method of immunoprecipitation. The results showed that the interaction between Ezrin and CD44 increased after the acquisition of energy, and ezrin could not only interact with the unmodified forms of CD44, but also interact with the form of glycosylated modification. (6) finally, the possible functions of Ezrin and actin in the capacitation were analyzed with ezri, respectively. N and actin antibodies blocked the capacitation and acrosome reaction. The results showed that Ezrin and actin antibodies blocked sperm capacitation but had no effect on the acrosome reaction.
In conclusion, a new hypothesis is proposed for the molecular mechanism of human sperm capacitation, that ezrin, RhoGDI1, actin, RhoA and membrane proteins can form a protein network through interaction in human sperm capacitation, which can regulate the recombination of spermatozoa in the process of capacitation, the redistribution of the sperm membrane protein, and thus promote the redistribution of the sperm membrane protein. The fertilization process of spermatozoon and egg.
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R321

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