本文選題：肝細胞癌 + HBx蛋白�。� 參考：《暨南大學》2009年碩士論文

【摘要】： 目的:構(gòu)建乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)HBx蛋白表達載體pEYFP-C1-X及人IGF-Ⅱ基因P4啟動子調(diào)控的熒光素酶報告載體pGL3-P4,并初步探討HBx蛋白對IGF-Ⅱ基因P4啟動子活性的影響,為下一步研究HBx蛋白對IGF-Ⅱ基因P4啟動子甲基化狀態(tài)的影響及其細胞信號轉(zhuǎn)導通路奠定基礎。 方法:1.以pCMV-tag2B-X的乙型肝炎病毒X基因序列為模板,設計含有限制性內(nèi)切酶位點EcoRⅠ和SalⅠ的引物,PCR擴增X基因,并將純化的PCR產(chǎn)物定向克隆入pEYFP-C1質(zhì)粒的EcoRⅠ-SalⅠ位點,構(gòu)建成表達HBx蛋白的表達載體pEYFP-C1-X。 2.根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫及相關文獻,設計P4啟動子片段的巢式PCR引物,以胎肝細胞基因組為模板,PCR擴增P4啟動子片段,并將其定向克隆入熒光素酶報告載體pGL3-Basic的KpnⅠ-HindⅢ位點,構(gòu)建P4啟動子調(diào)控的熒光素酶報告載體pGL3-P4。 3.將pGL3-P4報告載體用SssICpG甲基轉(zhuǎn)移酶孵育,使pGL3-P4甲基化。 4.將重組質(zhì)粒pEYFP-C1-X轉(zhuǎn)染HepG2和Hela經(jīng)G418篩選后形成穩(wěn)定細胞系列后,將體外甲基化pGL3-P4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染上述細胞,并檢測P4啟動子熒光素酶的活性。 結(jié)果:1.經(jīng)限制性內(nèi)酶切、PCR反應及測序結(jié)果鑒定,證實成功構(gòu)建pEYFP-C1-X。 2.經(jīng)限制性內(nèi)酶切及測序證實成功構(gòu)建P4啟動子的pGL3-Basic真核表達載體。 3.雙熒光素酶檢測結(jié)果初步顯示HBx蛋白能增加IGF-ⅡP4啟動子活性。 結(jié)論:1.本實驗成功克隆了HBV X基因,并構(gòu)建了表達HBx蛋白的真核表達載體pEYFP-C1-X。 2.成功克隆IGF-ⅡP4啟動子基因,并構(gòu)建P4啟動子的pGL3-Basic載體。 3.初步顯示HBx蛋白能增加IGF-ⅡP4啟動子活性。 4.為下一步IGF-ⅡP4啟動子低甲基化機制的研究奠定基礎。
[Abstract]:Objective: to construct the expression vector pEYFP-C1-X and the luciferase report vector pGL3-P4 regulated by P4 promoter of human IGF- 鈪，

本文編號：2033814