本文選題：SARS-CoV + 干擾素　； 參考：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2009年博士論文

【摘要】： 第一部分SARS-CoV與干擾素系統(tǒng)的相互作用 本部分對不同干擾素抑制SARS-CoV的作用進(jìn)行了比較,并對干擾素的抗SARS-CoV作用途徑進(jìn)行了初步探索;研究了SARS-CoV部分輔助蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白對IFN-β啟動子和ISG54啟動子的作用。 在VeroE6細(xì)胞和Caco-2兩種細(xì)胞系中通過觀察CPE確定了干擾素抑制SARS-CoV復(fù)制的作用,通過計(jì)算IFN-β、IFN-ω和IFN-α的EC50得到結(jié)論:IFN-β與IFN-ω的作用相似,但二者均大于IFN-α。使用定量PCR方法對不同干擾素保護(hù)后的細(xì)胞病毒拷貝數(shù)進(jìn)行了檢測,發(fā)現(xiàn)IFN-β和IFN-ω作用后,細(xì)胞中的病毒拷貝數(shù)明顯降低,IFN-α作用后的降低幅度低于IFN-β和IFN-ω。干擾素抑制SARS-CoV作用是通過其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、最后通過效應(yīng)分子的表達(dá)來發(fā)揮作用。干擾素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路涉及的分子很多,本研究使用PCR Array高通量法對這些信號分子進(jìn)行篩選,以期得到具有顯著變化的分子并驗(yàn)證其作用。PCR Array結(jié)果發(fā)現(xiàn)許多分子都出現(xiàn)了表達(dá)上調(diào),包括干擾素相關(guān)基因、干擾素受體、干擾素調(diào)節(jié)因子和干擾素誘導(dǎo)蛋白,其中部分干擾素誘導(dǎo)蛋白的上調(diào)達(dá)到了千倍,這表明在SARS-CoV感染的Caco-2細(xì)胞中,干擾素通過受體表達(dá)上調(diào)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)因子的變化最終通過干擾素效應(yīng)分子的表達(dá)增加而發(fā)揮抑制SARS-CoV復(fù)制的作用。對PKR、OAS和MxA三種干擾素抗病毒途徑的研究發(fā)現(xiàn),IFN-β、IFN-ω和IFN-α預(yù)處理的細(xì)胞中,OAS的表達(dá)都出現(xiàn)了近20倍的上調(diào),而PKR和MxA的表達(dá)沒有出現(xiàn)明顯上調(diào)。推測OAS途徑可能是干擾素發(fā)揮抗病毒作用的途徑之一。通過外源表達(dá)PKR、OAS和MxA蛋白,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染OAS的細(xì)胞中SARS-CoV的病毒拷貝數(shù)出現(xiàn)明顯下降,低于MxA和PKR,說明OAS在干擾素抑制SARS-CoV復(fù)制的過程中發(fā)揮了一定的作用。 干擾素能夠抑制SARS-CoV復(fù)制,而SARS-CoV也以特有的模式來干擾干擾素的誘導(dǎo)產(chǎn)生,從而逃避干擾素效應(yīng)分子的抑制作用。從SARS-CoV的非結(jié)構(gòu)蛋白中篩選對IFN-β啟動子和ISG54啟動子具有抑制作用的分子,發(fā)現(xiàn)NSP6和ORF8a對IFN-β啟動子和ISG54啟動子具有抑制作用,抑制率達(dá)50%以上。3a和7a蛋白能夠有效增強(qiáng)IFN-β啟動子啟動的熒光素酶的表達(dá)。 第二部分EV71與干擾素系統(tǒng)的相互作用 EV71是一種比較常見的腸道病毒,多數(shù)人感染EV71后,不會有任何癥狀,只有極少數(shù)人會發(fā)病,而發(fā)病者80%以上是5歲以下兒童。干擾素是治療病毒感染的常用藥物,深入研究干擾素與EV71的相互作用對于指導(dǎo)臨床應(yīng)用很有必要。 首先對病毒株進(jìn)行了基因組測序、亞型鑒定,基因組測序表明本實(shí)驗(yàn)中所使用EV71株基因組除3’端外含7324個(gè)核苷酸,基因組編碼區(qū)起自5’端第743位堿基,止于7324位堿基。本株與2008年安徽阜陽流行的其它幾個(gè)病毒株相比,同源性都在97%以上。與2007年流行的518-01F/SD/CHN/07株的同源性達(dá)到99%,病毒VP1基因未發(fā)生明顯變異,在進(jìn)化上屬C4基因亞型。 在Vero E6細(xì)胞中比較了先加干擾素再感染病毒和病毒感染后再加干擾素兩種處理方式之間的干擾素抗病毒的活性差異,分別從CPE、結(jié)晶紫染色、定量PCR、TCID50和細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察等方面驗(yàn)證了IFN-β和IFN-ω抑制EV71復(fù)制的作用。隨后對EV71感染后干擾素不同加入時(shí)間的細(xì)胞保護(hù)作用進(jìn)行了探索,在EV71感染后6h以內(nèi)加入干擾素可以有效地抑制病毒復(fù)制,而在病毒感染48h后再加入干擾素則對細(xì)胞沒有保護(hù)作用。在EV71感染后,干擾素加入的時(shí)間越早對細(xì)胞的保護(hù)作用越強(qiáng)。 接下來研究了EV71誘導(dǎo)干擾素系統(tǒng)發(fā)揮作用的能力,發(fā)現(xiàn)EV71不能誘導(dǎo)IFN-β和ISG54啟動子的表達(dá)。IRF3是IFN-β表達(dá)調(diào)節(jié)的重要轉(zhuǎn)錄因子,本研究中與對照病毒NDV相比,EV71不能誘導(dǎo)IRF3二聚體化及磷酸化,免疫熒光結(jié)果也表明EV71對細(xì)胞內(nèi)IRF3的核轉(zhuǎn)移沒有促進(jìn)作用,說明EV71通過抑制IRF3的激活來阻止干擾素系統(tǒng)的激活。 EV71僅有一個(gè)開放閱讀框,編碼VP1、VP2、VP3和VP4四個(gè)病毒外殼蛋白和2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D七個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白。為了說明這些病毒蛋白對干擾素信號通路的影響,研究了它們對IFN-β和ISG54啟動子的作用,發(fā)現(xiàn)單獨(dú)的病毒蛋白均沒有明顯地誘導(dǎo)或抑制IFN-β和ISG54啟動子的作用。
[Abstract]:First part SARS - CoV interaction with interferon system



In this part , the effects of different interferon on SARS - CoV were compared , and the anti - SARS - CoV action pathway of interferon was studied . The effects of SARS - CoV and non - structural proteins on IFN - 尾 promoter and ISG54 promoter were studied .



The effect of IFN - 尾 , IFN - 蠅 and IFN - 偽 on the expression of IFN - 尾 , IFN - 蠅 and IFN - .



IFN - 尾 promoter and ISG54 promoter have been screened from SARS - CoV non - structural protein . The results show that NSP6 and ORF8a can inhibit the expression of IFN - 尾 promoter and ISG54 promoter .



Interaction between the second part EV71 and the interferon system



EV71 is a common enteroviruses . Most people will not have any symptoms after EV71 infection . Only a few people will develop , and more than 80 % of them are children under the age of 5 . IFN is a common drug for viral infections . The study of the interaction between interferon and EV71 is necessary to guide clinical application .



The genome sequencing , subtype identification and genome sequencing showed that the genome of EV71 strain used in this experiment was 7324 nucleotides except the 3 ' end .



The effect of IFN - 尾 and IFN - 蠅 on the replication of EV71 was studied in Vero E6 cells . The effect of IFN - 尾 and IFN - 蠅 on the replication of EV71 was verified by means of CPE , crystal violet staining , quantitative PCR , TC50 and morphological observation .



It was found that EV71 could not induce the expression of IFN - 尾 and ISG54 promoter . The expression of IFN - 尾 and ISG54 promoter was not induced by EV71 . The IRF3 was an important transcription factor for IFN - 尾 expression regulation . In this study , EV71 did not induce IRF3 dimer and phosphorylation , and the results of immunofluorescence showed that EV71 did not promote the nuclear transfer of IRF3 in the cell , suggesting that EV71 prevented the activation of the interferon system by inhibiting the activation of IRF3 .



In order to illustrate the effects of these viral proteins on IFN - 尾 and ISG54 promoters , the effect of these viral proteins on IFN - 尾 and ISG54 promoters was investigated .
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R373

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 徐春娥;陳薇;;干擾素系統(tǒng)與病毒的相互作用[J];中國生物工程雜志;2006年04期

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本文編號：2026978