本文選題：肌營養(yǎng)不良 + DMD基因　； 參考：《南方醫(yī)科大學》2009年博士論文

【摘要】： DMD基因突變是假肥大型肌營養(yǎng)不良癥的分子病理基礎,其中大片段缺失約占所有突變類型的65%。依據閱讀框學說,通常DMD基因移碼突變導致Duchenne型肌營養(yǎng)不良(Duchenne muscular dystrophy,DMD),而整碼突變導致Becker型肌營養(yǎng)不良(Becker muscular dystrophy,BMD)。DMD基因缺失的機制甚為復雜,但在DMD基因發(fā)生斷裂缺失后大都通過非同源末端連接進行修復。DMD基因缺失連接片段即為DMD基因斷端重接形成的一段變異的DNA序列。 對連接片段進行克隆和序列特點分析,可以為研究DMD基因缺失重組機制提供幫助;同時采用PCR技術擴增這段變異的DNA序列可以考慮用于缺失型DMD/BMD攜帶者檢測和產前診斷。我們進行的研究工作分為三個部分:一、DMD基因缺失和5例中國人連接片段序列分析;二、利用連接片段進行缺失型DMD/BMD攜帶者檢測;三、連接片段在缺失型DMD/BMD產前診斷的應用和評價。 一、DMD基因缺失和5例中國人連接片段序列分析 1.研究目的 通過閱讀框規(guī)則分析所選缺失型DMD/BMD患者基因型與表型的關系;通過進行DMD基因缺失連接片段測序,分析中國人連接片段序列的一些特點并探討DMD基因缺失和修復的機制。 2.方法 研究對象:6例經證實的缺失型DMD/BMD患者。其中病例1、病例2、病例3、病例4為DMD,病例5、病例6為BMD,來自同一家系,故實際互相無血緣關系的研究對象為5例。抽提制備以上患者外周血基因組DNA。 DMD基因缺失突變的閱讀框檢測:通過外顯子PCR檢測確定病例1為DMD基因第46～50外顯子缺失,病例2為第51～55外顯子缺失,病例3為第31～43外顯子缺失,病例4為第45～54外顯子缺失,相同家系的病例5、病例6為第3～5外顯子缺失。采用在線程序對以上6例研究對象進行外顯子缺失的閱讀框檢測,判斷其缺失突變所致可讀框改變類型。 連接片段的克隆和測序:在研究對象DMD基因缺失斷裂點所在的相應內含子上每間隔一定距離(一般為3 kb)設計1對引物,通過PCR步移的方法定位相應內含子上的斷裂點位點。對5例研究對象內含子上斷裂點位點成功定位后,分別在靠近其上下游斷裂點處各設計1對配對引物,以直接對各例連接片段進行長片段PCR擴增,將擴增成功的PCR產物純化后測序。 連接片段的序列特點分析:對所測5例中國人連接片段5'端和3'端斷裂點兩側的序列進行重復序列、基質附著區(qū)(matrix attachment regions,MARs)、回文序列、TTTAAA序列以及基因缺失后修復方式的分析。 3.結果 6例病例基因型和表型的關系:經檢測病例1、病例2、病例3、病例4的缺失突變均屬框外缺失(out-of-frame deletion),為改變遺傳信息可讀框的移碼突變,其相應的臨床表型均為DMD。同一家系的病例5、病例6的缺失突變屬框內缺失(in-frame deletion),為缺失下游仍然保持正常可讀框的整碼突變,其相應的臨床表型為BMD。 5例中國人連接片段的序列特點:分析發(fā)現JUNCTION 1的5'端斷裂點位于第45內含子LINE/L1序列內,鄰近MAR,附近存在回文序列,其3'端斷裂點鄰近第50內含子的MAR;JUNCTION 2的5'端斷裂點附近存在回文序列,其3'端斷裂點位于第55內含子LINE/L1序列內;JUNCTION 3的5'端斷裂點位于第30內含子LINE/L1序列內,附近存在回文序列;JUNCTION 4的5'端斷裂點位于第44內含子LINE/L1序列內,鄰近MAR,其3'端斷裂點兩旁存在回文序列;JUNCTION 5的5'端斷裂點位于第2內含子SINE/Alu序列內,其3'端斷裂點鄰近第5內含子的MAR,附近有TTTAAA序列。 5例DMD基因缺失相連接的序列均無廣泛同源性。發(fā)現JUNCTION 1具有5 bp的微小同源序列連接斷裂點兩端;JUNCTION 2為平端連接,另外在其5'端斷裂點上游39 bp位置發(fā)現一處A→G點突變;JUNCTION 3插入7 bp序列連接斷裂點兩端;JUNCTION 4具有4 bp的微小同源序列連接斷裂點兩端;JUNCTION 5插入26 bp序列并在連接點周圍形成3個13 bp的重復連接斷裂點兩端,且在其5'端斷裂點上游20 bp位置發(fā)現一處A→G點突變。 4.結論 6例假肥大型肌營養(yǎng)不良癥病例基因型和表型的關系均符合閱讀框規(guī)則,其中4例為out-of-frame缺失突變導致DMD,2例為in-frame缺失突變導致BMD。 DMD基因的一些二級結構特點促進其斷裂重組。5例中國人連接片段序列總體上具備容易導致DMD基因缺失重組的所有分子結構特點,包括重復序列、MARs、回文序列、TTTAAA序列等。并且5例中國人連接片段均采取非同源末端連接進行修復,其連接特點包括微小同源性、小的插入、重復、平端連接。 二、利用連接片段進行缺失型DMD/BMD攜帶者檢測 1.研究目的 依據DMD基因缺失后斷端重接可形成的一段變異的DNA序列,提出一種利用連接片段進行缺失型DMD/BMD攜帶者檢測的新方法。 2.方法 研究對象:2個DMD/BMD家系和1個散發(fā)病例家庭的女性親屬。其中家系1為一個BMD家系,家系中Ⅲ_1、Ⅲ_4為確診的患者,先證者Ⅲ_1(病例5)已證實為第3～5外顯子缺失并已克隆其連接片段JUNCTION 5,Ⅲ_1的母親Ⅱ_2、Ⅲ_4的女兒Ⅳ4為肯定攜帶者,Ⅲ_1的妹妹Ⅲ_3為可能攜帶者;家系2為一個DMD家系,其中先證者Ⅲ_2(病例3)已證實為第31～43外顯子缺失并已克隆其連接片段JUNCTION 3,Ⅲ_2的母親Ⅱ_3為肯定攜帶者;病例4為一DMD散發(fā)病例,已證實為第45～54外顯子缺失并已克隆其連接片段JUNCTION 4,其母親待檢測排除為攜帶者。抽提制備以上檢測對象外周血基因組DNA。 攜帶者檢測:在連接片段序列已被成功測序的情況下,對擴增以上JUNCTION 5、JUNCTION 3、JUNCTION 4的引物進行重新設計減短PCR產物長度,以提高常規(guī)PCR擴增連接片段的成功率。然后以相應的新設計3對引物D4-F/R、D31-F/R2、D6-F/R分別對以上2個家系中女性待檢測對象和病例4母親可能存在的連接片段進行PCR擴增和測序,同時擴增患者的連接片段作對照。 3.結果 家系1檢測結果:對家系1的3例女性Ⅲ_3、Ⅱ_2、Ⅳ4的連接片段PCR反應均為擴增出與患者Ⅲ_1、Ⅲ_4一致的陽性結果,同時比較Ⅲ_3、Ⅱ_2、Ⅳ_4與Ⅲ_1、Ⅲ_4的連接片段的測序結果無差異,診斷家系1的Ⅲ_3、Ⅱ_2、Ⅳ4均為BMD女性攜帶者。 家系2檢測結果:對家系2的1例女性Ⅱ_3的連接片段PCR反應為擴增出與患者Ⅲ_2一致的陽性結果,同時比較Ⅱ_3與Ⅲ_2的連接片段的測序結果無差異,診斷家系2的Ⅱ_3為DMD女性攜帶者。 病例4的母親檢測結果:對病例4的母親的連接片段PCR反應結果為擴增陰性,而對照的病例4擴增出陽性結果,可以排除病例4的母親為DMD女性攜帶者。 4.結論 在對DMD/BMD先證者的連接片段的進行克隆和測序后,利用常規(guī)PCR技術直接檢測待診女性親屬是否帶有連接片段,可以達到準確進行攜帶者檢測的目的。 通過測序分析表明相同家系中患者和女性攜帶者連接片段的序列完全一致,因此盡管不同家系患者的DMD基因缺失情況各異,但一般而言同一家系DMD基因缺失的基因型相同。 三、連接片段在缺失型DMD/BMD產前診斷的應用和評價 1.研究目的 探討利用連接片段進行缺失型DMD/BMD產前診斷的方法,通過實施評價其優(yōu)勢和不足。 2.方法 研究對象:在家系1的Ⅲ_3確診為女性攜帶者之后,在知情同意的情況下將其作為實施產前診斷的對象。攜帶者Ⅲ_3共妊娠3次,其中Ⅳ_1、Ⅳ_2為先后兩次人工流產的絨毛。Ⅳ_3為第三次妊娠待診胎兒,分別在孕11周絨毛取樣和孕20周取羊水標本進行產前診斷。抽提制備以上標本基因組DNA。 人流絨毛的基因診斷方法:以新設計引物D4-F/R分別對以上2例人流絨毛Ⅳ_1、Ⅳ_2可能存在的連接片段進行PCR擴增和測序,同時擴增先證者Ⅲ_1的連接片段作為對照;以引物ex3-F/R分別檢測Ⅳ_1、Ⅳ_2是否有相應外顯子缺失;以擴增SPY基因的引物分別對Ⅳ_1、Ⅳ_2作性別鑒定。 產前診斷方法:以新設計引物D4-F/R分別對攜帶者Ⅲ_3在不同孕期所取絨毛組織和羊水可能存在的連接片段進行PCR擴增和測序,并擴增先證者Ⅲ_1的連接片段作為對照;以引物ex3-F/R分別檢測2次所取樣品的DMD基因第3外顯子,并以引物ex6-F/R擴增未缺失的第6外顯子作為正常對照,判斷是否有外顯子缺失;以擴增SRY基因的引物分別對2次所取樣品作性別鑒定。 3.結果 家系1的Ⅲ_3兩次人流絨毛的基因診斷結果:對第一次人流絨毛Ⅳ_1的連接片段PCR反應為擴增出與先證者Ⅲ_1一致的陽性結果,對Ⅳ_1第3外顯子的PCR檢測結果為擴增陽性無缺失,對Ⅳ_1性別鑒定結果為女性。同時比較Ⅳ_1與本家系先證者Ⅲ_1的連接片段的測序結果無差異,診斷攜帶者Ⅲ_3第一次人流絨毛Ⅳ_1為BMD女性攜帶者。 對第二次人流絨毛Ⅳ_2的連接片段PCR反應結果為擴增陰性,對Ⅳ_2第3外顯子的PCR檢測結果為擴增陽性無缺失,對Ⅳ_2性別鑒定結果為男性。診斷攜帶者Ⅲ_3第二次人流絨毛Ⅳ_2為正常男胎。 家系1的Ⅲ_3第三次妊娠產前診斷結果:對孕11周所取絨毛組織基因組DNA的連接片段PCR反應結果為擴增出與先證者Ⅲ_1一致的陽性結果,對其第3外顯子的PCR檢測結果為擴增陽性無缺失,性別鑒定結果為男性。男性胎兒出現檢測到DMD基因缺失連接片段而相應外顯子無缺失的矛盾結果,提示所取的絨毛樣品受到母體細胞污染。 對孕20周羊水細胞基因組DNA的連接片段PCR反應結果為擴增出與先證者Ⅲ_1一致的陽性結果,對其第3外顯子的PCR檢測結果為擴增陰性(經驗證第4外顯子同為PCR擴增陰性結果),存在相應的DMD基因缺失,性別鑒定結果為男性。同時比較該連接片段與本家系先證者Ⅲ_1的連接片段的測序結果無差異,診斷胎兒Ⅳ_3為BMD患病男胎并指導引產,取引產胎兒組織進行復查結果無誤。 4.結論 在缺失型DMD/BMD產前診斷上通過PCR擴增連接片段和檢測是否有相應的外顯子缺失,可以準確判斷男性胎兒是否為患病胎兒,并能有效鑒別檢測標本是否受到母體細胞污染。不足之處是比較繁瑣和耗時,且僅能應用于缺失型DMD/BMD。 總結: 1.6例缺失型DMD/BMD研究對象在DNA水平均符合閱讀框規(guī)則。 2.報道了迄今為止數量最多的東方亞洲人DMD基因缺失連接片段序列資料,共完成5例中國人連接片段的測序。 3.DMD基因的一些二級結構特點促進其斷裂重組。5例中國人連接片段序列總體上具備容易導致DMD基因缺失重組的所有分子結構特點,包括重復序列、MARs、回文序列、TTTAAA序列等。 4.5例中國人連接片段均為采取非同源末端連接進行修復,其連接特點包括微小同源性、小的插入、重復、平端連接。 5.首次對相同DMD/BMD家系中多個患者和攜帶者的DMD基因缺失連接片段進行測序分析。 6.發(fā)現盡管不同家系患者的DMD基因缺失情況各異,但一般而言同一家系DMD基因缺失的基因型相同。 7.成功利用常規(guī)PCR擴增連接片段的方法對3個不同缺失型DMD/BMD家庭進行攜帶者檢測。 8.該方法與目前常用攜帶者檢測方法的主要區(qū)別是不對DMD基因進行定量分析,只要對女性被檢者檢測出與先證者一致的連接片段即可確認為攜帶者,方法直觀、準確。 9.首次將連接片段應用于1例BMD女性攜帶者產前診斷,實現了利用連接片段進行缺失型DMD/BMD產前診斷的設想。 10.連接片段應用于DMD/BMD基因診斷的技術缺點是首先需要分析先證者的基因型,比較繁瑣和耗時,且僅能應用于缺失型DMD/BMD。 創(chuàng)新點: 1.克隆了5例新的DMD基因缺失突變序列。 2.首次將基于常規(guī)PCR技術擴增連接片段的方法應用于缺失型DMD/BMD攜帶者檢測和產前診斷。 3.突破了以往認為常規(guī)PCR技術不能檢測DMD/BMD攜帶者的觀點。 4.在缺失型DMD/BMD產前診斷上通過PCR擴增連接片段和檢測是否有相應的外顯子缺失,可以準確判斷男性胎兒是否為患病胎兒,并能有效鑒別檢測標本是否受到母體細胞污染。 5.該方法對檢測樣品需求量小,具有應用于植入前遺傳學診斷可行性。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R346

【參考文獻】

相關期刊論文 前9條

1 黎青;李少英;胡冬貴;孫筱放;陳敦金;張成;蔣瑋瑩;;假肥大型肌營養(yǎng)不良癥的產前基因診斷(英文)[J];北京大學學報(醫(yī)學版);2006年01期

2 鐘敏;潘速躍;陸兵勛;姜立;李偉;;Dystrophin基因3～5號外顯子缺失連接片段的克隆和測序[J];南方醫(yī)科大學學報;2006年06期

3 鐘敏;潘速躍;蔡麗丹;陸兵勛;張國忠;;在Dystrophin基因大內含子上定位缺失突變位點的策略[J];中國臨床康復;2006年12期

4 潘速躍,張成,劉焯霖,陳國俊,盧錫林;Dystrophin基因51號外顯子缺失連接片段的克隆和測序[J];遺傳學報;2002年02期

5 鐘敏;潘速躍;陸兵勛;;假肥大型肌營養(yǎng)不良患者dystrophin基因缺失斷裂點的分子結構特點[J];中華神經科雜志;2007年08期

6 盛文利,陳江瑛,潘速躍,張成,劉焯霖;缺失型杜氏肌營養(yǎng)不良癥缺失熱區(qū)內含子斷裂點分子結構特點的對比分析[J];中華醫(yī)學遺傳學雜志;2003年05期

7 鐘敏;潘速躍;陸兵勛;李偉;;dystrophin基因第45 ~54外顯子缺失連接片段的克隆和測序(英文)[J];中華醫(yī)學遺傳學雜志;2006年02期

8 盛文利,陳江瑛,朱良付,劉焯霖;DMD基因內含子的重復序列與內含子不穩(wěn)定性和基因缺失的關聯[J];中山大學學報(醫(yī)學科學版);2005年01期

9 陸國輝,陳天健,黃尚志,楊冬梓;產前診斷及其在國內應用的分析[J];中國優(yōu)生與遺傳雜志;2003年01期

，

本文編號：1996955