本文選題：肌營養(yǎng)不良 + DMD基因��； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2009年博士論文

【摘要】： DMD基因突變是假肥大型肌營養(yǎng)不良癥的分子病理基礎(chǔ),其中大片段缺失約占所有突變類型的65%。依據(jù)閱讀框?qū)W說,通常DMD基因移碼突變導(dǎo)致Duchenne型肌營養(yǎng)不良(Duchenne muscular dystrophy,DMD),而整碼突變導(dǎo)致Becker型肌營養(yǎng)不良(Becker muscular dystrophy,BMD)。DMD基因缺失的機(jī)制甚為復(fù)雜,但在DMD基因發(fā)生斷裂缺失后大都通過非同源末端連接進(jìn)行修復(fù)。DMD基因缺失連接片段即為DMD基因斷端重接形成的一段變異的DNA序列。 對(duì)連接片段進(jìn)行克隆和序列特點(diǎn)分析,可以為研究DMD基因缺失重組機(jī)制提供幫助;同時(shí)采用PCR技術(shù)擴(kuò)增這段變異的DNA序列可以考慮用于缺失型DMD/BMD攜帶者檢測(cè)和產(chǎn)前診斷。我們進(jìn)行的研究工作分為三個(gè)部分:一、DMD基因缺失和5例中國人連接片段序列分析;二、利用連接片段進(jìn)行缺失型DMD/BMD攜帶者檢測(cè);三、連接片段在缺失型DMD/BMD產(chǎn)前診斷的應(yīng)用和評(píng)價(jià)。 一、DMD基因缺失和5例中國人連接片段序列分析 1.研究目的 通過閱讀框規(guī)則分析所選缺失型DMD/BMD患者基因型與表型的關(guān)系;通過進(jìn)行DMD基因缺失連接片段測(cè)序,分析中國人連接片段序列的一些特點(diǎn)并探討DMD基因缺失和修復(fù)的機(jī)制。 2.方法 研究對(duì)象:6例經(jīng)證實(shí)的缺失型DMD/BMD患者。其中病例1、病例2、病例3、病例4為DMD,病例5、病例6為BMD,來自同一家系,故實(shí)際互相無血緣關(guān)系的研究對(duì)象為5例。抽提制備以上患者外周血基因組DNA。 DMD基因缺失突變的閱讀框檢測(cè):通過外顯子PCR檢測(cè)確定病例1為DMD基因第46～50外顯子缺失,病例2為第51～55外顯子缺失,病例3為第31～43外顯子缺失,病例4為第45～54外顯子缺失,相同家系的病例5、病例6為第3～5外顯子缺失。采用在線程序?qū)σ陨?例研究對(duì)象進(jìn)行外顯子缺失的閱讀框檢測(cè),判斷其缺失突變所致可讀框改變類型。 連接片段的克隆和測(cè)序:在研究對(duì)象DMD基因缺失斷裂點(diǎn)所在的相應(yīng)內(nèi)含子上每間隔一定距離(一般為3 kb)設(shè)計(jì)1對(duì)引物,通過PCR步移的方法定位相應(yīng)內(nèi)含子上的斷裂點(diǎn)位點(diǎn)。對(duì)5例研究對(duì)象內(nèi)含子上斷裂點(diǎn)位點(diǎn)成功定位后,分別在靠近其上下游斷裂點(diǎn)處各設(shè)計(jì)1對(duì)配對(duì)引物,以直接對(duì)各例連接片段進(jìn)行長片段PCR擴(kuò)增,將擴(kuò)增成功的PCR產(chǎn)物純化后測(cè)序。 連接片段的序列特點(diǎn)分析:對(duì)所測(cè)5例中國人連接片段5'端和3'端斷裂點(diǎn)兩側(cè)的序列進(jìn)行重復(fù)序列、基質(zhì)附著區(qū)(matrix attachment regions,MARs)、回文序列、TTTAAA序列以及基因缺失后修復(fù)方式的分析。 3.結(jié)果 6例病例基因型和表型的關(guān)系:經(jīng)檢測(cè)病例1、病例2、病例3、病例4的缺失突變均屬框外缺失(out-of-frame deletion),為改變遺傳信息可讀框的移碼突變,其相應(yīng)的臨床表型均為DMD。同一家系的病例5、病例6的缺失突變屬框內(nèi)缺失(in-frame deletion),為缺失下游仍然保持正�？勺x框的整碼突變,其相應(yīng)的臨床表型為BMD。 5例中國人連接片段的序列特點(diǎn):分析發(fā)現(xiàn)JUNCTION 1的5'端斷裂點(diǎn)位于第45內(nèi)含子LINE/L1序列內(nèi),鄰近MAR,附近存在回文序列,其3'端斷裂點(diǎn)鄰近第50內(nèi)含子的MAR;JUNCTION 2的5'端斷裂點(diǎn)附近存在回文序列,其3'端斷裂點(diǎn)位于第55內(nèi)含子LINE/L1序列內(nèi);JUNCTION 3的5'端斷裂點(diǎn)位于第30內(nèi)含子LINE/L1序列內(nèi),附近存在回文序列;JUNCTION 4的5'端斷裂點(diǎn)位于第44內(nèi)含子LINE/L1序列內(nèi),鄰近MAR,其3'端斷裂點(diǎn)兩旁存在回文序列;JUNCTION 5的5'端斷裂點(diǎn)位于第2內(nèi)含子SINE/Alu序列內(nèi),其3'端斷裂點(diǎn)鄰近第5內(nèi)含子的MAR,附近有TTTAAA序列。 5例DMD基因缺失相連接的序列均無廣泛同源性。發(fā)現(xiàn)JUNCTION 1具有5 bp的微小同源序列連接斷裂點(diǎn)兩端;JUNCTION 2為平端連接,另外在其5'端斷裂點(diǎn)上游39 bp位置發(fā)現(xiàn)一處A→G點(diǎn)突變;JUNCTION 3插入7 bp序列連接斷裂點(diǎn)兩端;JUNCTION 4具有4 bp的微小同源序列連接斷裂點(diǎn)兩端;JUNCTION 5插入26 bp序列并在連接點(diǎn)周圍形成3個(gè)13 bp的重復(fù)連接斷裂點(diǎn)兩端,且在其5'端斷裂點(diǎn)上游20 bp位置發(fā)現(xiàn)一處A→G點(diǎn)突變。 4.結(jié)論 6例假肥大型肌營養(yǎng)不良癥病例基因型和表型的關(guān)系均符合閱讀框規(guī)則,其中4例為out-of-frame缺失突變導(dǎo)致DMD,2例為in-frame缺失突變導(dǎo)致BMD。 DMD基因的一些二級(jí)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)促進(jìn)其斷裂重組。5例中國人連接片段序列總體上具備容易導(dǎo)致DMD基因缺失重組的所有分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn),包括重復(fù)序列、MARs、回文序列、TTTAAA序列等。并且5例中國人連接片段均采取非同源末端連接進(jìn)行修復(fù),其連接特點(diǎn)包括微小同源性、小的插入、重復(fù)、平端連接。 二、利用連接片段進(jìn)行缺失型DMD/BMD攜帶者檢測(cè) 1.研究目的 依據(jù)DMD基因缺失后斷端重接可形成的一段變異的DNA序列,提出一種利用連接片段進(jìn)行缺失型DMD/BMD攜帶者檢測(cè)的新方法。 2.方法 研究對(duì)象:2個(gè)DMD/BMD家系和1個(gè)散發(fā)病例家庭的女性親屬。其中家系1為一個(gè)BMD家系,家系中Ⅲ_1、Ⅲ_4為確診的患者,先證者Ⅲ_1(病例5)已證實(shí)為第3～5外顯子缺失并已克隆其連接片段JUNCTION 5,Ⅲ_1的母親Ⅱ_2、Ⅲ_4的女兒Ⅳ4為肯定攜帶者,Ⅲ_1的妹妹Ⅲ_3為可能攜帶者;家系2為一個(gè)DMD家系,其中先證者Ⅲ_2(病例3)已證實(shí)為第31～43外顯子缺失并已克隆其連接片段JUNCTION 3,Ⅲ_2的母親Ⅱ_3為肯定攜帶者;病例4為一DMD散發(fā)病例,已證實(shí)為第45～54外顯子缺失并已克隆其連接片段JUNCTION 4,其母親待檢測(cè)排除為攜帶者。抽提制備以上檢測(cè)對(duì)象外周血基因組DNA。 攜帶者檢測(cè):在連接片段序列已被成功測(cè)序的情況下,對(duì)擴(kuò)增以上JUNCTION 5、JUNCTION 3、JUNCTION 4的引物進(jìn)行重新設(shè)計(jì)減短PCR產(chǎn)物長度,以提高常規(guī)PCR擴(kuò)增連接片段的成功率。然后以相應(yīng)的新設(shè)計(jì)3對(duì)引物D4-F/R、D31-F/R2、D6-F/R分別對(duì)以上2個(gè)家系中女性待檢測(cè)對(duì)象和病例4母親可能存在的連接片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序,同時(shí)擴(kuò)增患者的連接片段作對(duì)照。 3.結(jié)果 家系1檢測(cè)結(jié)果:對(duì)家系1的3例女性Ⅲ_3、Ⅱ_2、Ⅳ4的連接片段PCR反應(yīng)均為擴(kuò)增出與患者Ⅲ_1、Ⅲ_4一致的陽性結(jié)果,同時(shí)比較Ⅲ_3、Ⅱ_2、Ⅳ_4與Ⅲ_1、Ⅲ_4的連接片段的測(cè)序結(jié)果無差異,診斷家系1的Ⅲ_3、Ⅱ_2、Ⅳ4均為BMD女性攜帶者。 家系2檢測(cè)結(jié)果:對(duì)家系2的1例女性Ⅱ_3的連接片段PCR反應(yīng)為擴(kuò)增出與患者Ⅲ_2一致的陽性結(jié)果,同時(shí)比較Ⅱ_3與Ⅲ_2的連接片段的測(cè)序結(jié)果無差異,診斷家系2的Ⅱ_3為DMD女性攜帶者。 病例4的母親檢測(cè)結(jié)果:對(duì)病例4的母親的連接片段PCR反應(yīng)結(jié)果為擴(kuò)增陰性,而對(duì)照的病例4擴(kuò)增出陽性結(jié)果,可以排除病例4的母親為DMD女性攜帶者。 4.結(jié)論 在對(duì)DMD/BMD先證者的連接片段的進(jìn)行克隆和測(cè)序后,利用常規(guī)PCR技術(shù)直接檢測(cè)待診女性親屬是否帶有連接片段,可以達(dá)到準(zhǔn)確進(jìn)行攜帶者檢測(cè)的目的。 通過測(cè)序分析表明相同家系中患者和女性攜帶者連接片段的序列完全一致,因此盡管不同家系患者的DMD基因缺失情況各異,但一般而言同一家系DMD基因缺失的基因型相同。 三、連接片段在缺失型DMD/BMD產(chǎn)前診斷的應(yīng)用和評(píng)價(jià) 1.研究目的 探討利用連接片段進(jìn)行缺失型DMD/BMD產(chǎn)前診斷的方法,通過實(shí)施評(píng)價(jià)其優(yōu)勢(shì)和不足。 2.方法 研究對(duì)象:在家系1的Ⅲ_3確診為女性攜帶者之后,在知情同意的情況下將其作為實(shí)施產(chǎn)前診斷的對(duì)象。攜帶者Ⅲ_3共妊娠3次,其中Ⅳ_1、Ⅳ_2為先后兩次人工流產(chǎn)的絨毛。Ⅳ_3為第三次妊娠待診胎兒,分別在孕11周絨毛取樣和孕20周取羊水標(biāo)本進(jìn)行產(chǎn)前診斷。抽提制備以上標(biāo)本基因組DNA。 人流絨毛的基因診斷方法:以新設(shè)計(jì)引物D4-F/R分別對(duì)以上2例人流絨毛Ⅳ_1、Ⅳ_2可能存在的連接片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序,同時(shí)擴(kuò)增先證者Ⅲ_1的連接片段作為對(duì)照;以引物ex3-F/R分別檢測(cè)Ⅳ_1、Ⅳ_2是否有相應(yīng)外顯子缺失;以擴(kuò)增SPY基因的引物分別對(duì)Ⅳ_1、Ⅳ_2作性別鑒定。 產(chǎn)前診斷方法:以新設(shè)計(jì)引物D4-F/R分別對(duì)攜帶者Ⅲ_3在不同孕期所取絨毛組織和羊水可能存在的連接片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序,并擴(kuò)增先證者Ⅲ_1的連接片段作為對(duì)照;以引物ex3-F/R分別檢測(cè)2次所取樣品的DMD基因第3外顯子,并以引物ex6-F/R擴(kuò)增未缺失的第6外顯子作為正常對(duì)照,判斷是否有外顯子缺失;以擴(kuò)增SRY基因的引物分別對(duì)2次所取樣品作性別鑒定。 3.結(jié)果 家系1的Ⅲ_3兩次人流絨毛的基因診斷結(jié)果:對(duì)第一次人流絨毛Ⅳ_1的連接片段PCR反應(yīng)為擴(kuò)增出與先證者Ⅲ_1一致的陽性結(jié)果,對(duì)Ⅳ_1第3外顯子的PCR檢測(cè)結(jié)果為擴(kuò)增陽性無缺失,對(duì)Ⅳ_1性別鑒定結(jié)果為女性。同時(shí)比較Ⅳ_1與本家系先證者Ⅲ_1的連接片段的測(cè)序結(jié)果無差異,診斷攜帶者Ⅲ_3第一次人流絨毛Ⅳ_1為BMD女性攜帶者。 對(duì)第二次人流絨毛Ⅳ_2的連接片段PCR反應(yīng)結(jié)果為擴(kuò)增陰性,對(duì)Ⅳ_2第3外顯子的PCR檢測(cè)結(jié)果為擴(kuò)增陽性無缺失,對(duì)Ⅳ_2性別鑒定結(jié)果為男性。診斷攜帶者Ⅲ_3第二次人流絨毛Ⅳ_2為正常男胎。 家系1的Ⅲ_3第三次妊娠產(chǎn)前診斷結(jié)果:對(duì)孕11周所取絨毛組織基因組DNA的連接片段PCR反應(yīng)結(jié)果為擴(kuò)增出與先證者Ⅲ_1一致的陽性結(jié)果,對(duì)其第3外顯子的PCR檢測(cè)結(jié)果為擴(kuò)增陽性無缺失,性別鑒定結(jié)果為男性。男性胎兒出現(xiàn)檢測(cè)到DMD基因缺失連接片段而相應(yīng)外顯子無缺失的矛盾結(jié)果,提示所取的絨毛樣品受到母體細(xì)胞污染。 對(duì)孕20周羊水細(xì)胞基因組DNA的連接片段PCR反應(yīng)結(jié)果為擴(kuò)增出與先證者Ⅲ_1一致的陽性結(jié)果,對(duì)其第3外顯子的PCR檢測(cè)結(jié)果為擴(kuò)增陰性(經(jīng)驗(yàn)證第4外顯子同為PCR擴(kuò)增陰性結(jié)果),存在相應(yīng)的DMD基因缺失,性別鑒定結(jié)果為男性。同時(shí)比較該連接片段與本家系先證者Ⅲ_1的連接片段的測(cè)序結(jié)果無差異,診斷胎兒Ⅳ_3為BMD患病男胎并指導(dǎo)引產(chǎn),取引產(chǎn)胎兒組織進(jìn)行復(fù)查結(jié)果無誤。 4.結(jié)論 在缺失型DMD/BMD產(chǎn)前診斷上通過PCR擴(kuò)增連接片段和檢測(cè)是否有相應(yīng)的外顯子缺失,可以準(zhǔn)確判斷男性胎兒是否為患病胎兒,并能有效鑒別檢測(cè)標(biāo)本是否受到母體細(xì)胞污染。不足之處是比較繁瑣和耗時(shí),且僅能應(yīng)用于缺失型DMD/BMD。 總結(jié): 1.6例缺失型DMD/BMD研究對(duì)象在DNA水平均符合閱讀框規(guī)則。 2.報(bào)道了迄今為止數(shù)量最多的東方亞洲人DMD基因缺失連接片段序列資料,共完成5例中國人連接片段的測(cè)序。 3.DMD基因的一些二級(jí)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)促進(jìn)其斷裂重組。5例中國人連接片段序列總體上具備容易導(dǎo)致DMD基因缺失重組的所有分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn),包括重復(fù)序列、MARs、回文序列、TTTAAA序列等。 4.5例中國人連接片段均為采取非同源末端連接進(jìn)行修復(fù),其連接特點(diǎn)包括微小同源性、小的插入、重復(fù)、平端連接。 5.首次對(duì)相同DMD/BMD家系中多個(gè)患者和攜帶者的DMD基因缺失連接片段進(jìn)行測(cè)序分析。 6.發(fā)現(xiàn)盡管不同家系患者的DMD基因缺失情況各異,但一般而言同一家系DMD基因缺失的基因型相同。 7.成功利用常規(guī)PCR擴(kuò)增連接片段的方法對(duì)3個(gè)不同缺失型DMD/BMD家庭進(jìn)行攜帶者檢測(cè)。 8.該方法與目前常用攜帶者檢測(cè)方法的主要區(qū)別是不對(duì)DMD基因進(jìn)行定量分析,只要對(duì)女性被檢者檢測(cè)出與先證者一致的連接片段即可確認(rèn)為攜帶者,方法直觀、準(zhǔn)確。 9.首次將連接片段應(yīng)用于1例BMD女性攜帶者產(chǎn)前診斷,實(shí)現(xiàn)了利用連接片段進(jìn)行缺失型DMD/BMD產(chǎn)前診斷的設(shè)想。 10.連接片段應(yīng)用于DMD/BMD基因診斷的技術(shù)缺點(diǎn)是首先需要分析先證者的基因型,比較繁瑣和耗時(shí),且僅能應(yīng)用于缺失型DMD/BMD。 創(chuàng)新點(diǎn): 1.克隆了5例新的DMD基因缺失突變序列。 2.首次將基于常規(guī)PCR技術(shù)擴(kuò)增連接片段的方法應(yīng)用于缺失型DMD/BMD攜帶者檢測(cè)和產(chǎn)前診斷。 3.突破了以往認(rèn)為常規(guī)PCR技術(shù)不能檢測(cè)DMD/BMD攜帶者的觀點(diǎn)。 4.在缺失型DMD/BMD產(chǎn)前診斷上通過PCR擴(kuò)增連接片段和檢測(cè)是否有相應(yīng)的外顯子缺失,可以準(zhǔn)確判斷男性胎兒是否為患病胎兒,并能有效鑒別檢測(cè)標(biāo)本是否受到母體細(xì)胞污染。 5.該方法對(duì)檢測(cè)樣品需求量小,具有應(yīng)用于植入前遺傳學(xué)診斷可行性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R346

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1996955