本文選題：附睪蛋白酶抑制蛋白 + 避孕疫苗��； 參考：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2009年博士論文

【摘要】： 世界人口持續(xù)增長(zhǎng)的壓力和非計(jì)劃妊娠對(duì)生殖健康的危害使人們深刻認(rèn)識(shí)到進(jìn)一步完善避孕措施的迫切性。目前針對(duì)男性的避孕措施僅限于安全套和輸精管結(jié)扎,前者不夠方便,后者不可逆,因而遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足需求。開發(fā)更方便、高效、安全、可逆的男性避孕方法成為計(jì)劃生育研究的重要課題。迄今,男性避孕疫苗候選分子很多,但尚面臨避孕效果不理想以及T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫損傷等局限。針對(duì)這兩個(gè)局限,設(shè)計(jì)新的疫苗形式和免疫策略實(shí)現(xiàn)突破,對(duì)開發(fā)安全、有效的避孕疫苗具有重要意義。 附睪蛋白酶抑制蛋白(Epidydimal protease inhibitor, Eppin)基因的發(fā)現(xiàn)為男性避孕疫苗的開發(fā)帶來(lái)了曙光。Eppin蛋白特異表達(dá)于睪丸和附睪,在精子成熟中具有重要作用�？笶ppin抗體可直接破壞Eppin-精囊凝固蛋白(Semenogelin, Sg)復(fù)合體,干擾Eppin調(diào)控前列腺特異性抗原對(duì)Sg的水解作用,影響精子活動(dòng)力,進(jìn)而抑制生育力。利用重組Eppin蛋白免疫雄猴獲得了較理想的避孕效果(78%),停止免疫后,71%的受試雄猴恢復(fù)了生育力。由此可見,Eppin可望作為男性避孕的有效靶點(diǎn),但仍需針對(duì)男性避孕疫苗存在的上述局限尋求突破。篩選獲得Eppin優(yōu)勢(shì)中和B細(xì)胞表位,并通過免疫小鼠研究其抗生育有效性和安全性是本研究的目的。 出于安全考慮,全長(zhǎng)蛋白不適于用作疫苗,找出真正抑制生育的關(guān)鍵性表位并增強(qiáng)其免疫原性和避孕效果是關(guān)鍵�；诿庖邔W(xué)基本理論,我們?cè)O(shè)想,用全長(zhǎng)Eppin蛋白免疫,將會(huì)產(chǎn)生針對(duì)其各個(gè)表位的記憶細(xì)胞克隆,當(dāng)只用某個(gè)表位肽再次免疫時(shí),則只有針對(duì)該表位的記憶細(xì)胞被激活、增殖進(jìn)而分泌抗體。如果初次免疫采用重組人Eppin蛋白(recombinant human Eppin, rhEppin),加強(qiáng)免疫分別采用各候選表位肽,則可以通過所產(chǎn)生的抗體滴度高低來(lái)判斷該表位是否優(yōu)勢(shì)表位;而通過分析被免疫小鼠的生育力抑制效果及其抗血清對(duì)精子活力的體外抑制能力,則可判斷該表位是否中和性表位。因此,我們擬采用該策略來(lái)篩選Eppin的優(yōu)勢(shì)中和B細(xì)胞表位并研究其抗生育潛能。 本研究首先通過RT-PCR法從人新鮮睪丸組織擴(kuò)增獲得Eppin cDNA,構(gòu)建入原核表達(dá)載體,誘導(dǎo)表達(dá)并經(jīng)純化獲得重組人Eppin蛋白(第一部分)。同時(shí),通過計(jì)算機(jī)軟件分析Eppin蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)及表面特性,預(yù)測(cè)出Eppin蛋白的B細(xì)胞表位所在區(qū)域;并通過與抗血清的結(jié)合試驗(yàn)進(jìn)行初步篩選,得出Eppin候選優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞表位區(qū)段(第二部分)。最后,采用rhEppin初次免疫,上述候選表位肽加強(qiáng)免疫的策略,觀察各個(gè)表位肽刺激抗體產(chǎn)生、抗體對(duì)精子活力的抑制能力,以此進(jìn)一步篩選出其優(yōu)勢(shì)中和B細(xì)胞表位,并以rhEppin重復(fù)免疫為對(duì)照,分析其抗生育潛能及安全性(第三部分)。 結(jié)果發(fā)現(xiàn):①通過分析Eppin蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)及表面特性(包括蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、親水性、可塑性、溶劑可及性及免疫原性等),初步預(yù)測(cè)出Eppin蛋白的B細(xì)胞表位區(qū)域在第19～31、30～44、58～70、73～85、94～102、103～115、113～124、125～132區(qū)段;與抗血清的結(jié)合試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)第58～70、19～31、103～115、113~124區(qū)域的抗原性相對(duì)較強(qiáng),從而初步篩選得出了Eppin候選優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞表位(前述四個(gè)肽分別命名為肽A～D)。②進(jìn)一步采用rhEppin初次免疫-候選表位肽加強(qiáng)免疫的篩選策略,發(fā)現(xiàn)用四個(gè)候選表位肽加強(qiáng)免疫時(shí)都能激發(fā)產(chǎn)生高滴度的抗體,并維持至8~9個(gè)月,而僅B肽、C肽和D肽加強(qiáng)免疫時(shí)所獲得的抗血清能與人精子天然Eppin蛋白結(jié)合,其中僅C肽加強(qiáng)免疫獲得的抗血清能顯著抑制人精子活力。從而獲知Eppin優(yōu)勢(shì)中和B細(xì)胞表位所在區(qū)段為Eppin103-115。③接受rhEppin初次免疫-表位肽C加強(qiáng)免疫的雄鼠(EC組),只能使26.6%的雌鼠受孕,與PBS組(88.9%)相比顯著降低,說(shuō)明雄鼠的生育力受到抑制;而免疫8～9個(gè)月后,伴隨抗體滴度下降,該組雄鼠能使雌鼠的受孕率達(dá)80%,與PBS組(87%)無(wú)顯著差別,說(shuō)明避孕作用具有可逆性。④接受rhEppin重復(fù)免疫的雄鼠(Eppin組),產(chǎn)生的抗體滴度雖略高于EC組,而抗生育效果兩組相當(dāng)。Eppin組和EC組都只是顯著抑制了附睪精子的活力,而性激素水平、精子生成等均未受影響。各組織器官的病理檢查也未發(fā)現(xiàn)異常。但理論上,采用rhEppin初次免疫-候選表位肽加強(qiáng)免疫策略,產(chǎn)生的抗體更多針對(duì)該表位肽,從而更具有安全性。 本研究結(jié)果表明計(jì)算機(jī)表位預(yù)測(cè)結(jié)合蛋白初免-表位肽加強(qiáng)免疫策略是篩選蛋白優(yōu)勢(shì)中和B細(xì)胞表位的有效方法和又一選擇;Eppin蛋白的第103-115區(qū)段是Eppin優(yōu)勢(shì)中和B細(xì)胞表位所在區(qū)域;rhEppin初次免疫-表位肽C加強(qiáng)免疫策略用于免疫避孕具有較好的安全性和有效性。鑒于Eppin蛋白在人和鼠的遺傳差異,尚需在靈長(zhǎng)類動(dòng)物進(jìn)一步研究證實(shí)。
[Abstract]:At present , male contraception is limited to condom and vasectomy , the former is not convenient , the latter is not reversible , thus far unable to meet the need . To date , the male contraceptive vaccine candidate molecule is many , but it is still facing the limitation of contraception effect is not ideal and T cell - mediated immune injury and so on , aiming at these two limitations , designing new vaccine form and immune strategy to achieve breakthrough , has important significance for developing safe and effective contraceptive vaccine .



The discovery of Epidydimal protease inhibitor ( Eosin ) gene has brought a light for the development of male contraceptive vaccine . Eosin protein is expressed specifically in the testis and appendix , which plays an important role in sperm maturation .



For safety reasons , the full - length protein is not suitable for use as a vaccine . It is crucial to find out the key epitopes that truly inhibit fertility and to enhance its immunogenicity and contraceptive effectiveness .



In the first part , the Eosin cDNA was amplified from human fresh testis tissue by RT - PCR . It was constructed into prokaryotic expression vector to induce the expression and purification to obtain recombinant human Eosin protein ( Part I ) . At the same time , the epitope of B cells was predicted by computer software .



The results showed that : ( 1 ) The level of B - cell epitopes was significantly lower than that in PBS group ( 88 . 9 % ) , and the anti - fertility effect was significantly lower than that in PBS group ( 88 . 9 % ) , and the anti - fertility effect was significantly lower than that of PBS group ( 88 . 9 % ) .



The results of this study indicate that the epitope peptide enhanced immune strategy is an effective method and a choice for the selection of epitope of B cells . The 103 - 115 segment of Eosin protein is the region where the epitope of B cells is located ; the primary immunization - epitope peptide C enhanced immune strategy is used in the immune contraception to have better safety and effectiveness .
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 吳玉章;免疫識(shí)別、分子設(shè)計(jì)與抗原工程[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2000年10期

2 呂燕波,萬(wàn)瑛,吳玉章;SARS病毒基因組所編碼的E蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)[J];免疫學(xué)雜志;2003年06期

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本文編號(hào)：1995785