發(fā)布時間：2018-06-07 21:57

  本文選題：牛分枝桿菌 + 主要分泌型免疫蛋白(MPB70)��； 參考：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院》2010年碩士論文

【摘要】： 自1882年德國細菌學家Koch發(fā)現(xiàn)結核分枝桿菌以來，已報道的分枝桿菌有100多種。國際上通常將分枝桿菌分為典型結核分枝桿菌(Tuberculosismycobacterium，TM)和非結核分枝桿菌(Non-tuberculosis mycobacterium, NTM)。TM包括結核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲結核分枝桿菌，又稱為結核分枝桿菌復合群( Mycobacterium tuberculosis complex，MTBC)，NTM指MTBC和麻風分枝桿菌以外的其它所有分枝桿菌。 牛分枝桿菌可在人與動物之間傳播，近年來發(fā)現(xiàn)一部分人類結核是由牛分枝桿菌引起并有增多的趨勢，已成為值得關注的公共衛(wèi)生問題。牛分枝桿菌有廣泛的宿主，最為常見的是牛、獾和鹿。研究表明，感染牛分枝桿菌的動物可通過痰液、乳汁、糞便等向外排菌而污染環(huán)境，因此，控制動物結核是控制人類結核的重要環(huán)節(jié)。牛結核的檢疫方法目前大多使用牛分枝桿菌純蛋白衍生物（PPD-M）皮膚敏感試驗（TST），48小時才能得出試驗結果，但PPD中許多抗原成分為非致病性環(huán)境分枝桿菌和卡介苗（BCG）所共有，并不能區(qū)別非致病性分枝桿菌和牛分枝桿菌感染，檢測結果可能出現(xiàn)假陽性。 膠體金免疫層析方法有方便，快速等諸多優(yōu)點，近年來受到廣泛關注，膠體金是指氯金酸在一些還原劑如維生素C、檸檬酸鈉等的作用下所形成特定大小的金顆粒。在適宜pH條件下，膠體金顆粒表面帶負電荷，可與蛋白質所帶正電核基團形成非共價鍵而牢固結合，，這種結合對蛋白的生物學活性無明顯影響。膠體金顆粒對蛋白質有較強的吸附作用，可與葡萄球菌A蛋白(SPA)、免疫球蛋白等諸多生物大分子非共價結合。 牛分枝桿菌主要分泌性免疫蛋白70(MPB70)和表面脂蛋白83(MPB83)是其兩個主要抗原成分，在感染早期誘導機體產生細胞免疫和體液免疫，且抗體在血清中的含量與疾病發(fā)展呈正相關。雖然結核分枝桿菌也存在這兩個抗原成分，但表達量極低，因此，檢測MPB70和MPB83抗體對于牛分枝桿菌感染診斷具有重要意義。 本研究采用聚合酶鏈反應（polymerse chain reaction，PCR）從牛分枝桿菌基因組中擴增mpb70和mpb83基因片段，分別插入原核質粒pET-32a(+)，獲得重組表達質粒pET-32a(+)-mpb70和pET-32a(+)-mpb83，轉化感受態(tài)細胞后，選取陽性克隆，陽性克隆經測序表明目的基因已插入表達質粒，核苷酸序列與牛分枝桿菌標準株AF2122/97同源性為100%。經過表達條件的摸索，在1mM IPTG 37℃誘導3小時，可獲得rMPB70和rMPB83高效表達，目的蛋白約占菌體總蛋白的60%以上，且目的蛋白以包涵體表達為主。pET-32a(+)表達載體因融合有硫氧還蛋白和S蛋白，預測rMPB70分子量約為42kDa，rMPB83分子量約為45kDa，SDS-PAGE分析rMPB70和rMPB83大小與預測結果相符。rMPB70和rMPB83蛋白包涵體用尿素變性，半透膜透析去除尿素復性蛋白，rMPB70和rMPB83純化后蛋白純度可達80%以上，WB實驗分析表明，rMPB70和rMPB83蛋白可與結核病牛血清發(fā)生特異反應，說明rMPB70和rMPB83蛋白具有較好的抗原性。 本研究探索了rMPB70和rMPB83在膠體金免疫層析試劑中的初步應用，用檸檬酸三鈉作為還原劑來制備膠體金顆粒，并利用SPA能與多種哺乳動物IgG結合的特性，用膠體金標記的SPA制備免疫探針，用不同濃度的rMPB70和rMPB83蛋白分別作為靶抗原致敏硝酸纖維素膜，確定rMPB70和rMPB83蛋白的最佳致敏濃度分別為4.5mg/ml、3mg/ml。組裝試紙條，并分別用TST陽性牛血清；正常牛血清和生理鹽水層析試紙條，15min后觀察結果。實驗室初步考核顯示，用rMPB70蛋白制備的膠體金試劑檢測30份TST陽性牛血清，20份呈陽性，敏感性66%；用rMPB83蛋白制備的的膠體金試劑檢測30份TST陽性牛血清，22份呈陽性，敏感性73%。而分別檢測正常牛血清和生理鹽水均呈陰性，顯示本研究獲得的rMPB70，rMPB83蛋白可以作為捕獲抗原用于制備牛結核抗體免疫膠體金試劑。
[Abstract]:The M.tuberculosis has been reported to have more than 100 Mycobacterium tuberculosis since the discovery of Mycobacterium tuberculosis by the German bacteriologist Koch . In the world , Mycobacterium tuberculosis is generally divided into Mycobacterium tuberculosis ( TM ) and Non - tuberculosis Mycobacterium tuberculosis . TM includes Mycobacterium tuberculosis , Mycobacterium tuberculosis , Mycobacterium tuberculosis , also known as Mycobacterium tuberculosis complex ( MTBC ) , which refers to all other Mycobacteria other than MTBC and M . M . M .



In recent years , it has been found that a part of human tuberculosis is caused by Mycobacterium species and has an increased tendency . It has become an important part of the control of human tuberculosis .



The colloidal gold immunochromatography method has many advantages , such as convenient , rapid and so on . In recent years , the colloidal gold refers to gold particles of certain size under the action of some reducing agents such as vitamin C , sodium citrate and the like .



The main secretory immune protein 70 ( MPB70 ) and the surface lipoprotein 83 ( MPB83 ) are two major antigenic components , which induce cellular immunity and humoral immunity at the early stage of infection , and the content of the antibody in serum is positively correlated with the development of disease . Although Mycobacterium tuberculosis also has the two antigenic components , the expression amount is very low , so the detection of MPB70 and MPB83 antibodies has important significance for the diagnosis of Mycobacterium tuberculosis infection .



Recombinant expression plasmid pET - 32a ( + ) - mpb70 and pET - 32a ( + ) - mpb83 were inserted into pET - 32a ( + ) - mpb70 and pET - 32a ( + ) - mpb83 respectively .



In this study , the preliminary application of rMPB70 and rMPB83 in colloidal gold immunochromatography reagent was explored . The colloidal gold particles were prepared by using trisodium citrate as reducing agent , and SPA can be used as the reducing agent to prepare the colloidal gold particles . Using SPA to prepare the immune probe , the optimal sensitizing concentration of rMPB70 and rMPB83 protein was 4.5 mg / ml and 3 mg / ml respectively .
The results were observed after 15 min of normal bovine serum and normal saline chromatography . The results showed that the colloidal gold reagent prepared by rMPB70 protein was positive and sensitive 66 % .
The results showed that the rMPB70 and rMPB83 protein could be used as capture antigen to prepare immune colloidal gold reagent for bovine tuberculosis antibody .
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R346

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