發(fā)布時(shí)間：2018-06-06 23:48

  本文選題：臍帶 + 間充質(zhì)干細(xì)胞��； 參考：《汕頭大學(xué)》2009年碩士論文

【摘要】： 背景與目的:不孕癥的發(fā)生率日益升高,約占育齡夫婦的15%,其中由男方原因引起者約占一半。男性不育大部分可以通過輔助生殖技術(shù)得到糾正,但由于生殖細(xì)胞缺乏所致的不育無法通過輔助生殖技術(shù)治療。干細(xì)胞具有多向分化的潛能,可以分化為各種組織的細(xì)胞包括生殖細(xì)胞;已有研究證實(shí)胚胎干細(xì)胞、成體干細(xì)胞在一定的條件下可以分化為雄性生殖細(xì)胞,因此干細(xì)胞移植為治療男性不育提供了新的解決途徑。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(HUMSCs)也是一種成體干細(xì)胞,理論上也可以向男性生殖細(xì)胞分化。本課題主要研究HUMSCs體外在人絕經(jīng)期促性腺激素及維甲酸誘導(dǎo)培養(yǎng)下向男性生殖細(xì)胞方向分化的情況;并將HUMSCs移植到不育小鼠睪丸曲細(xì)輸精管內(nèi),觀察其在不育小鼠體內(nèi)存活及向男性生殖細(xì)胞方向分化的能力。 方法:采取組織塊貼壁培養(yǎng)方法獲得HUMSCs,體外采取人絕經(jīng)期促性腺激素及維甲酸進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),誘導(dǎo)后在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化,誘導(dǎo)培養(yǎng)8-14天后行細(xì)胞免疫化學(xué)、PT-PCR檢測(cè)誘導(dǎo)后的細(xì)胞生殖細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)情況。體內(nèi)研究方面,脂質(zhì)體介導(dǎo)增強(qiáng)綠色熒光蛋白質(zhì)粒pIRES2-EGFP轉(zhuǎn)染HUMSCs,轉(zhuǎn)染后經(jīng)顯微注射方法移植到不育小鼠睪丸曲細(xì)輸精管,細(xì)胞移植40-120天后行免疫組化、免疫熒光觀察移植后的HUMSCs在受體小鼠睪丸內(nèi)存活及向男性生殖細(xì)胞方向分化的情況。 結(jié)果:HUMSCs在人絕經(jīng)期促性腺激素及維甲酸進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)8-14天后,在光鏡顯微鏡下觀察可見部分細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變,部分長(zhǎng)條型的細(xì)胞逐漸變圓,細(xì)胞器增多,行細(xì)胞免疫化學(xué)染色顯示HUMSCs誘導(dǎo)后能表達(dá)生殖細(xì)胞的部分標(biāo)記VASA,Oct4,而未誘導(dǎo)的細(xì)胞成陰性表達(dá);RT-PCR顯示誘導(dǎo)后的細(xì)胞表達(dá)α6基因,未誘導(dǎo)的細(xì)胞未見α6基因的表達(dá)。HUMSCs移植到不育小鼠睪丸曲細(xì)輸精管40-120天后行免疫組化、免疫熒光觀察。免疫組化觀察可見細(xì)胞移植40-70天能表達(dá)生殖細(xì)胞的標(biāo)記:VASA、α6、C-kit和Oct4成陽性表達(dá),而未移植細(xì)胞的睪丸組織未見VASA、α6、C-kit和Oct4.表達(dá)。免疫熒光顯示細(xì)胞移植40-60天在受體睪丸內(nèi)可以觀察到綠色熒光信號(hào),少部分表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞同時(shí)表達(dá)生殖細(xì)胞特異性標(biāo)記VASA、α6、C-kit和Oct4。對(duì)照組未移植細(xì)胞的小鼠睪丸組織未見陽性表達(dá)。 結(jié)論:HUMSCs在人絕經(jīng)期促性腺激素及維甲酸進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)下能表達(dá)生殖細(xì)胞的部分特征;移植到不育小鼠睪丸曲細(xì)輸精管后能在異種小鼠睪丸中存活,并表達(dá)生殖細(xì)胞部分特征。體內(nèi)外定向誘導(dǎo)HUMSCs可能可以向男性生殖細(xì)胞方向分化,HUMSCs將可能為細(xì)胞移植治療男性不育提供一種新的細(xì)胞來源,提供一條新的治療途徑。
[Abstract]:Background and objective: the incidence of infertility is increasing, accounting for about 15% of the couples of childbearing age, of which about half of them are caused by male causes. Most male infertility can be corrected by assisted reproductive technology, but infertility can not be treated by assisted reproductive technology because of the lack of germ cells. Stem cells have the potential for multiple differentiation. The cells that can be differentiated into various tissues include germ cells. Studies have shown that embryonic stem cells, adult stem cells can differentiate into male reproductive cells under certain conditions, so stem cell transplantation provides a new solution for the treatment of male infertility. Human umbilical cord mesenchymal stem cells (HUMSCs) are also a kind of adult stem cells. It can also differentiate into male germ cells. This topic mainly studies the differentiation of HUMSCs in human menopause gonadotropin and retinoic acid induced differentiation to male germ cells, and transplants HUMSCs into the testicular fine vas deferens in sterile mice to observe the survival of the male sterile mice and the direction of male germ cells in the male sterile mice. The ability to differentiate.
Methods: HUMSCs was obtained by tissue block wall culture. Human menopause gonadotropin and retinoic acid were used to induce culture in vitro. After induction, the morphological changes of cells were observed under the microscope. Cell immunocytochemistry was performed for 8-14 days after induction of culture. PT-PCR was used to detect the expression of markers of cell germ cells after induction. The liposome mediated green fluorescent protein particles pIRES2-EGFP transfected to HUMSCs, and transplanted into the testicular fine vas deferens in sterile mice after transfection. After 40-120 days of transplantation, immunofluorescence was performed. The immunofluorescence was used to observe the survival of the transplanted HUMSCs in the testis of the recipient mice and the direction of the male germ cells.
Results: after 8-14 days of induction and culture of gonadotropin and retinoic acid in human menopause, the morphologic changes of some cells were observed under light microscope, and some of the cells became round and organelles increased. Cell immunocytochemical staining showed that the partial markers of VASA and Oct4 could be expressed after HUMSCs induction. The uninduced cells expressed negative expression, RT-PCR showed that the induced cells expressed the alpha 6 gene, and the uninduced cells did not have the expression of alpha 6 gene expression.HUMSCs transplanted to the testicular fine vas deferens in sterile mice for 40-120 days after immunofluorescence, immunofluorescence observation. The immunofluorescence observation showed that the cell transplantation could express the marker of germ cells for 40-70 days: VASA, The positive expression of alpha 6, C-kit and Oct4 was positive, while no VASA, alpha 6, C-kit and Oct4. were found in the testis of untransplanted cells. Immunofluorescence showed that green fluorescent signals could be observed in the testicles of the recipient 40-60 days, and a few cells expressing green fluorescence were also expressed in the germ cell specific marker VASA, and the control group of alpha 6, C-kit and Oct4. was not. No positive expression of transplanted cells in mouse testis was observed.
Conclusion: HUMSCs can express some characteristics of reproductive cells in the induced culture of human menopause gonadotropin and retinoic acid, and can survive in the testis of xenogeneic mice after transplantation to the testicular fine vas deferens in sterile mice, and express the characteristics of germ cells. In vivo and in vivo, HUMSCs may be able to differentiate into male germ cells in vivo and in vivo. HUMSCs may provide a new cell source for cell transplantation in the treatment of male infertility, and provide a new way of treatment.
【學(xué)位授予單位】：汕頭大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R329

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本文編號(hào)：1988653