本文選題：結核分枝桿菌 + T-bet��； 參考：《安徽理工大學》2014年碩士論文

【摘要】：目的 通過原核表達TAT-Ag85B融合蛋白,與T-bet基因佐劑配伍構建新型抗結核病復合疫苗,評價新型疫苗的免疫原性及抗結核感染的保護作用,探究新型復合疫苗增強免疫應答的機制,為新型結核疫苗的研發(fā)提供新的思路和理論基礎。 方法 .1.根據GenBank報道的目的基因(Ag85B和TAT-PTD基因)全長序列,構建pET-28a-TAT-Ag85B和pET-28a-Ag85B重組質粒,經菌液PCR、質粒雙酶切及測序鑒定。 2.將含有pET28a-TAT-Ag85B和pET-28a-Ag85B質粒的重組大腸桿菌經IPTG誘導、鎳離子親和層析純化Ag85B、TAT-Ag85B蛋白,用Western blot法鑒定純化后的蛋白。 3.將Ag85B、TAT-Ag85B蛋白和本實驗室保存的pcDNA3.1-T-bet質粒免疫BALB/c小鼠,末次免疫結束后用ELISA法檢測小鼠血清中抗Ag85B抗體滴度。同時將小鼠脾臟淋巴細胞于Ag85B或TAT-Ag85B刺激下培養(yǎng),ELISA法檢測培養(yǎng)液中細胞因子分泌情況。 4.將各組末次免疫結束后的小鼠經尾靜脈注射感染結核分枝桿菌標準株H37Rv,在感染后第一、二、四、八周檢測小鼠肺和脾內結核菌載量并在感染后八周取肺臟做組織病理切片。 5.用Ag85B、TAT-Ag85B蛋白分別刺激小鼠腹腔巨噬細胞,免疫熒光觀察巨噬細胞內Ag85B蛋白的分布,Western blot檢測細胞內Ag85B蛋白的含量,流式細胞術檢測巨噬細胞表面分子CD80/CD86的表達。 結果 1.成功構建pET-28a-TAT-Ag85B和pET-28a-Ag85B質粒,PCR鑒定、質粒雙酶切鑒定和測序鑒定結果正確。 2.含有pET28a-TAT-Ag85B和pET-28a-Ag85B質粒的大腸桿菌經誘導、表達、純化得到重組Ag85B.TAT-Ag85B蛋白,經Western blot鑒定為所需目的蛋白。 3.使用ELISA方法檢測各組免疫小鼠血清中抗Ag85B抗體滴度情況,發(fā)現總IgG抗體效價中,TAT-Ag85B/T-bet組最高,高于其他實驗組；TAT-Ag85B/T-bet與TAT-Ag85B、Ag85B組相比IgG2a抗體滴度明顯增高(P0.05), IgG1滴度明顯降低(P0.05)；從脾細胞分泌細胞因子水平來看,TAT-Ag85B/T-bet組小鼠IFN-γy/IL-2水平顯著升高(P0.05), IL-4/IL-10水平低于Ag85B和TAT-Ag85B組(P0.05)。 4.H37Rv感染各組小鼠后,在第1周和第2周,各組小鼠的肺組織和脾組織結核菌載量無明顯差異,在第4周TAT-Ag85B/T-bet組小鼠肺組織和脾組織結核菌載量明顯低于PBS對照組(P0.05),在第8周時,TAT-Ag85B/T-bet、脾和肺組織結核菌載量低于對照組,有顯著性差異(P0.05)；從肺組織大體外觀判斷,與對照組小鼠肺部外側明顯的結核灶分布相比,TAT-Ag85B/T-bet免疫組肺部外觀幾乎無肉眼可見結核結節(jié)；HE染色發(fā)現TAT-Ag85B/T-bet免疫組小鼠的肺組織中病變明顯減輕,少量的充血、壞死和實變,有少量不明顯的肉芽腫結節(jié)形成；抗酸染色結果顯示在TAT-Ag85B/T-bet免疫的小鼠的肺組織中結核桿菌呈零星散在分布,無簇狀或片狀分布。 5.與Ag85B刺激巨噬細胞相比,TAT-Ag85B蛋白大量散在分布于巨噬細胞內,經TAT-Ag85B蛋白刺激后的巨噬細胞表面抗原提呈分子CD80/CD86表達熒光強度高于Ag85B蛋白。 結論 本研究初步闡明TAT-Ag85B蛋白疫苗輔以T-bet基因佐劑可以引起小鼠體內強烈的特異性免疫應答,并且以Thl優(yōu)勢免疫應答為主,對小鼠有一定的抗結核保護作用；TAT-Ag85B蛋白的跨膜轉運功能可能在提高巨噬細胞抗原提呈能力中起重要作用,并參與了增強的抗結核免疫應答；T-bet佐劑對Thl優(yōu)勢免疫的誘導具有重要作用�？傊�,該復合型疫苗的研究將為新型結核疫苗的研發(fā)提供新的思路和理論基礎。
[Abstract]:Purpose

Through prokaryotic expression TAT - Ag85B fusion protein , the novel anti - tuberculosis composite vaccine is combined with the T - bet gene adjuvant to evaluate the immunogenicity of the novel vaccine and the protective effect of anti - tuberculosis infection , and the mechanism for enhancing the immune response of the novel composite vaccine is explored , and a new thought and theoretical basis for the development of the novel tuberculosis vaccine is provided .

method

1 . The recombinant plasmids pET - 28a - TAT - Ag85B and pET - 28a - Ag85B were constructed according to the full - length sequence of the gene of interest ( Ag85B and TAT ) reported in GenBank . The recombinant plasmids of pET - 28a - TAT - Ag85B and pET - 28a - Ag85B were constructed .

2 . The recombinant E . coli containing pET28a - TAT - Ag85B and pET - 28a - Ag85B plasmid was induced by IPTG . Ag85B and TAT - Ag85B proteins were purified by nickel ion affinity chromatography . The purified protein was identified by Western blot .

3 . BALB / c mice were immunized with Ag85B , TAT - Ag85B protein and pcDNA3.1 - T - bet plasmid stored in this lab . After the last immunization , anti - Ag85B antibody titer was detected by ELISA . At the same time , mouse spleen lymphocytes were cultured under the stimulation of Ag85B or TAT - Ag85B , and the secretion of cytokines in the culture medium was detected by ELISA .

4 . After the final immunization of each group , the mice infected with Mycobacterium tuberculosis H37Rv were infected with Mycobacterium tuberculosis at the first , two , four and eight weeks after infection , and the lung and spleen of the mice were detected in eight weeks after infection , and the pathological sections of the lungs were taken after 8 weeks after infection .

5 . Ag85B and TAT - Ag85B protein were used to stimulate the distribution of Ag85B protein in macrophages . Western blot was used to detect the expression of Ag85B protein in macrophages . Western blot was used to detect the expression of Ag85B protein in macrophages .

Results

1 . pET - 28a - TAT - Ag85B and pET - 28a - Ag85B plasmid were constructed successfully , and the results were identified by PCR .

2 . E . coli containing pET28a - TAT - Ag85B and pET - 28a - Ag85B plasmid was induced , expressed and purified to obtain recombinant Ag85B . TAT - Ag85B protein , which was identified by Western blot as the desired protein .

3 . ELISA was used to detect the titer of anti - Ag85B antibody in serum of each group , and found that TAT - Ag85B / T - bet group was the highest in the total IgG antibody titer , which was higher than that of other experimental groups .
Compared with TAT - Ag85B , Ag85B , TAT - Ag85B / T - bet was significantly higher than that of TAT - Ag85B and Ag85B groups ( P0.05 ) .
The levels of IFN - 緯y / IL - 2 in TAT - Ag85B / T - bet group were significantly higher than that in TAT - Ag85B / T - bet group ( P0.05 ) . IL - 4 / IL - 10 levels were lower than that in Ag85B and TAT - Ag85B groups ( P0.05 ) .

4 . After infected with H37Rv , there was no significant difference between lung and spleen in groups 1 and 2 , and the amount of TB bacteria in lung and spleen in TAT - Ag85B / T - bet group was significantly lower than that in control group ( P0.05 ) . At 8th week , TAT - Ag85B / T - bet , spleen and lung tissue TB were significantly lower than that in the control group ( P0.05 ) .
Compared with the control group , the lung appearance of TAT - Ag85B / T - bet immune group was almost free from nodule nodules .
HE staining showed that in TAT - Ag85B / T - bet immune group , the pathological changes of lung tissue were obviously alleviated , and little congestion , necrosis and change were found , and there were few obvious granulomas nodule formation .
The results showed that Mycobacterium tuberculosis in the lung tissues of TAT - Ag85B / T - bet - immunized mice was sporadic in sporadic , non - clustered or sheet - like distribution .

5 . Compared with Ag85B stimulated macrophages , TAT - Ag85B protein was distributed in macrophages , and the fluorescence intensity of the surface antigen of macrophages stimulated by TAT - Ag85B protein was higher than that of Ag85B protein .

Conclusion

The results of this study indicate that TAT - Ag85B protein vaccine can induce a strong specific immune response in mice by using the T - bet gene adjuvant , and has a certain anti - tuberculosis protective effect on mice with Thl dominant immune response .
The transmembrane transport function of TAT - Ag85B protein may play an important role in increasing the antigen presentation ability of macrophages and participate in the enhanced anti - tuberculosis immune response .
T - bet adjuvant plays an important role in the induction of Thl dominant immune . In conclusion , the research of the compound vaccine will provide new ideas and theoretical bases for the research and development of new tuberculosis vaccines .
【學位授予單位】：安徽理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R392

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本文編號：1977096