本文選題：結(jié)核分枝桿菌 + T-bet��； 參考：《安徽理工大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：目的 通過原核表達TAT-Ag85B融合蛋白,與T-bet基因佐劑配伍構(gòu)建新型抗結(jié)核病復(fù)合疫苗,評價新型疫苗的免疫原性及抗結(jié)核感染的保護作用,探究新型復(fù)合疫苗增強免疫應(yīng)答的機制,為新型結(jié)核疫苗的研發(fā)提供新的思路和理論基礎(chǔ)。 方法 .1.根據(jù)GenBank報道的目的基因(Ag85B和TAT-PTD基因)全長序列,構(gòu)建pET-28a-TAT-Ag85B和pET-28a-Ag85B重組質(zhì)粒,經(jīng)菌液PCR、質(zhì)粒雙酶切及測序鑒定。 2.將含有pET28a-TAT-Ag85B和pET-28a-Ag85B質(zhì)粒的重組大腸桿菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)、鎳離子親和層析純化Ag85B、TAT-Ag85B蛋白,用Western blot法鑒定純化后的蛋白。 3.將Ag85B、TAT-Ag85B蛋白和本實驗室保存的pcDNA3.1-T-bet質(zhì)粒免疫BALB/c小鼠,末次免疫結(jié)束后用ELISA法檢測小鼠血清中抗Ag85B抗體滴度。同時將小鼠脾臟淋巴細(xì)胞于Ag85B或TAT-Ag85B刺激下培養(yǎng),ELISA法檢測培養(yǎng)液中細(xì)胞因子分泌情況。 4.將各組末次免疫結(jié)束后的小鼠經(jīng)尾靜脈注射感染結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv,在感染后第一、二、四、八周檢測小鼠肺和脾內(nèi)結(jié)核菌載量并在感染后八周取肺臟做組織病理切片。 5.用Ag85B、TAT-Ag85B蛋白分別刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞,免疫熒光觀察巨噬細(xì)胞內(nèi)Ag85B蛋白的分布,Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)Ag85B蛋白的含量,流式細(xì)胞術(shù)檢測巨噬細(xì)胞表面分子CD80/CD86的表達。 結(jié)果 1.成功構(gòu)建pET-28a-TAT-Ag85B和pET-28a-Ag85B質(zhì)粒,PCR鑒定、質(zhì)粒雙酶切鑒定和測序鑒定結(jié)果正確。 2.含有pET28a-TAT-Ag85B和pET-28a-Ag85B質(zhì)粒的大腸桿菌經(jīng)誘導(dǎo)、表達、純化得到重組Ag85B.TAT-Ag85B蛋白,經(jīng)Western blot鑒定為所需目的蛋白。 3.使用ELISA方法檢測各組免疫小鼠血清中抗Ag85B抗體滴度情況,發(fā)現(xiàn)總IgG抗體效價中,TAT-Ag85B/T-bet組最高,高于其他實驗組；TAT-Ag85B/T-bet與TAT-Ag85B、Ag85B組相比IgG2a抗體滴度明顯增高(P0.05), IgG1滴度明顯降低(P0.05)；從脾細(xì)胞分泌細(xì)胞因子水平來看,TAT-Ag85B/T-bet組小鼠IFN-γy/IL-2水平顯著升高(P0.05), IL-4/IL-10水平低于Ag85B和TAT-Ag85B組(P0.05)。 4.H37Rv感染各組小鼠后,在第1周和第2周,各組小鼠的肺組織和脾組織結(jié)核菌載量無明顯差異,在第4周TAT-Ag85B/T-bet組小鼠肺組織和脾組織結(jié)核菌載量明顯低于PBS對照組(P0.05),在第8周時,TAT-Ag85B/T-bet、脾和肺組織結(jié)核菌載量低于對照組,有顯著性差異(P0.05)；從肺組織大體外觀判斷,與對照組小鼠肺部外側(cè)明顯的結(jié)核灶分布相比,TAT-Ag85B/T-bet免疫組肺部外觀幾乎無肉眼可見結(jié)核結(jié)節(jié)；HE染色發(fā)現(xiàn)TAT-Ag85B/T-bet免疫組小鼠的肺組織中病變明顯減輕,少量的充血、壞死和實變,有少量不明顯的肉芽腫結(jié)節(jié)形成；抗酸染色結(jié)果顯示在TAT-Ag85B/T-bet免疫的小鼠的肺組織中結(jié)核桿菌呈零星散在分布,無簇狀或片狀分布。 5.與Ag85B刺激巨噬細(xì)胞相比,TAT-Ag85B蛋白大量散在分布于巨噬細(xì)胞內(nèi),經(jīng)TAT-Ag85B蛋白刺激后的巨噬細(xì)胞表面抗原提呈分子CD80/CD86表達熒光強度高于Ag85B蛋白。 結(jié)論 本研究初步闡明TAT-Ag85B蛋白疫苗輔以T-bet基因佐劑可以引起小鼠體內(nèi)強烈的特異性免疫應(yīng)答,并且以Thl優(yōu)勢免疫應(yīng)答為主,對小鼠有一定的抗結(jié)核保護作用；TAT-Ag85B蛋白的跨膜轉(zhuǎn)運功能可能在提高巨噬細(xì)胞抗原提呈能力中起重要作用,并參與了增強的抗結(jié)核免疫應(yīng)答；T-bet佐劑對Thl優(yōu)勢免疫的誘導(dǎo)具有重要作用。總之,該復(fù)合型疫苗的研究將為新型結(jié)核疫苗的研發(fā)提供新的思路和理論基礎(chǔ)。
[Abstract]:Purpose

Through prokaryotic expression TAT - Ag85B fusion protein , the novel anti - tuberculosis composite vaccine is combined with the T - bet gene adjuvant to evaluate the immunogenicity of the novel vaccine and the protective effect of anti - tuberculosis infection , and the mechanism for enhancing the immune response of the novel composite vaccine is explored , and a new thought and theoretical basis for the development of the novel tuberculosis vaccine is provided .

method

1 . The recombinant plasmids pET - 28a - TAT - Ag85B and pET - 28a - Ag85B were constructed according to the full - length sequence of the gene of interest ( Ag85B and TAT ) reported in GenBank . The recombinant plasmids of pET - 28a - TAT - Ag85B and pET - 28a - Ag85B were constructed .

2 . The recombinant E . coli containing pET28a - TAT - Ag85B and pET - 28a - Ag85B plasmid was induced by IPTG . Ag85B and TAT - Ag85B proteins were purified by nickel ion affinity chromatography . The purified protein was identified by Western blot .

3 . BALB / c mice were immunized with Ag85B , TAT - Ag85B protein and pcDNA3.1 - T - bet plasmid stored in this lab . After the last immunization , anti - Ag85B antibody titer was detected by ELISA . At the same time , mouse spleen lymphocytes were cultured under the stimulation of Ag85B or TAT - Ag85B , and the secretion of cytokines in the culture medium was detected by ELISA .

4 . After the final immunization of each group , the mice infected with Mycobacterium tuberculosis H37Rv were infected with Mycobacterium tuberculosis at the first , two , four and eight weeks after infection , and the lung and spleen of the mice were detected in eight weeks after infection , and the pathological sections of the lungs were taken after 8 weeks after infection .

5 . Ag85B and TAT - Ag85B protein were used to stimulate the distribution of Ag85B protein in macrophages . Western blot was used to detect the expression of Ag85B protein in macrophages . Western blot was used to detect the expression of Ag85B protein in macrophages .

Results

1 . pET - 28a - TAT - Ag85B and pET - 28a - Ag85B plasmid were constructed successfully , and the results were identified by PCR .

2 . E . coli containing pET28a - TAT - Ag85B and pET - 28a - Ag85B plasmid was induced , expressed and purified to obtain recombinant Ag85B . TAT - Ag85B protein , which was identified by Western blot as the desired protein .

3 . ELISA was used to detect the titer of anti - Ag85B antibody in serum of each group , and found that TAT - Ag85B / T - bet group was the highest in the total IgG antibody titer , which was higher than that of other experimental groups .
Compared with TAT - Ag85B , Ag85B , TAT - Ag85B / T - bet was significantly higher than that of TAT - Ag85B and Ag85B groups ( P0.05 ) .
The levels of IFN - 緯y / IL - 2 in TAT - Ag85B / T - bet group were significantly higher than that in TAT - Ag85B / T - bet group ( P0.05 ) . IL - 4 / IL - 10 levels were lower than that in Ag85B and TAT - Ag85B groups ( P0.05 ) .

4 . After infected with H37Rv , there was no significant difference between lung and spleen in groups 1 and 2 , and the amount of TB bacteria in lung and spleen in TAT - Ag85B / T - bet group was significantly lower than that in control group ( P0.05 ) . At 8th week , TAT - Ag85B / T - bet , spleen and lung tissue TB were significantly lower than that in the control group ( P0.05 ) .
Compared with the control group , the lung appearance of TAT - Ag85B / T - bet immune group was almost free from nodule nodules .
HE staining showed that in TAT - Ag85B / T - bet immune group , the pathological changes of lung tissue were obviously alleviated , and little congestion , necrosis and change were found , and there were few obvious granulomas nodule formation .
The results showed that Mycobacterium tuberculosis in the lung tissues of TAT - Ag85B / T - bet - immunized mice was sporadic in sporadic , non - clustered or sheet - like distribution .

5 . Compared with Ag85B stimulated macrophages , TAT - Ag85B protein was distributed in macrophages , and the fluorescence intensity of the surface antigen of macrophages stimulated by TAT - Ag85B protein was higher than that of Ag85B protein .

Conclusion

The results of this study indicate that TAT - Ag85B protein vaccine can induce a strong specific immune response in mice by using the T - bet gene adjuvant , and has a certain anti - tuberculosis protective effect on mice with Thl dominant immune response .
The transmembrane transport function of TAT - Ag85B protein may play an important role in increasing the antigen presentation ability of macrophages and participate in the enhanced anti - tuberculosis immune response .
T - bet adjuvant plays an important role in the induction of Thl dominant immune . In conclusion , the research of the compound vaccine will provide new ideas and theoretical bases for the research and development of new tuberculosis vaccines .
【學(xué)位授予單位】：安徽理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R392

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 馬中瑞;韓東雷;趙駿菲;陳夢琳;陳敏;;利用大腸桿菌生產(chǎn)N-糖蛋白和糖蛋白疫苗的研究進展[J];中國生物工程雜志;2013年11期

2 鄭麗舒;段招軍;;A型流感病毒M2蛋白疫苗的研究進展[J];病毒學(xué)報;2006年06期

3 潘芹芹,崔毓桂,龔光明,吉傳義,潘勇,王興海;LHRH融合蛋白疫苗對性成熟前小鼠性腺軸系的影響[J];中華男科學(xué)雜志;2005年08期

4 李文桂;陳雅棠;;豬帶絳蟲45W蛋白疫苗的研制現(xiàn)狀[J];中國病原生物學(xué)雜志;2012年03期

5 張冉,易新元,曾憲芳,張順科,蔡春,Larry McReynolds;日本血吸蟲Rho GTPase DNA疫苗及重組蛋白疫苗免疫保護機制初探[J];中國寄生蟲病防治雜志;2004年05期

6 宋娟;郭衛(wèi);柴景蕊;由振東;路長林;;可卡因-苯丙胺調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄肽蛋白疫苗在嗎啡鎮(zhèn)痛及其耐受中的作用[J];第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2008年04期

7 任繼玲;王華;楊明;王麗;吳秀麗;王麗穎;于永利;;人乳頭瘤病毒重組蛋白疫苗的計算機輔助設(shè)計及真核表達[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2010年01期

8 吳婷;歐山海;程通;何水珍;伍小路;鄭舟;張軍;夏寧邵;;戊型肝炎病毒重組顆粒性蛋白疫苗在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答研究[J];病毒學(xué)報;2005年06期

9 郝建軍;;亞單位糖蛋白疫苗免疫動物后原發(fā)無癥狀單純皰疹病毒感染的檢測[J];國外醫(yī)學(xué)(微生物學(xué)分冊);1990年06期

10 ;治療性乙肝蛋白疫苗有望打破乙肝免疫耐受態(tài)[J];透析與人工器官;2010年02期

相關(guān)會議論文 前4條

1 陳娟娟;;蛋白疫苗中佐劑應(yīng)用進展[A];第六屆全國免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會論文集[C];2008年

2 潘芹芹;崔毓桂;賈悅;王興海;;LHRH融合蛋白疫苗對性成熟前小鼠性腺軸系的影響[A];第一屆中華醫(yī)學(xué)會生殖醫(yī)學(xué)分會、中國動物學(xué)會生殖生物學(xué)分會聯(lián)合年會論文匯編[C];2007年

3 何曉文;章亞男;何穎;李凱;姜磊;孫樹漢;;乙肝DNA疫苗聯(lián)合基因工程蛋白疫苗提高免疫效果的研究[A];首屆長三角科技論壇——長三角生物醫(yī)藥發(fā)展論壇論文集[C];2004年

4 張淑芳;張吉鳳;高航;馬吉春;臺桂香;;重組人MUC1-MBP融合蛋白誘導(dǎo)小鼠Th1活化[A];第九屆全國腫瘤生物治療學(xué)術(shù)會議論文集[C];2006年

相關(guān)重要報紙文章 前2條

1 本報記者 董長青;萬克森：研制適合國人的蛋白疫苗[N];北京日報;2011年

2 彭勇;治療性疫苗有望打破乙肝免疫耐受[N];南方日報;2005年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前9條

1 宋欣欣;提高HPV融合蛋白疫苗療效策略研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2010年

2 劉波;雙功能HPV治療性融合蛋白疫苗的抗癌作用實驗研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2008年

3 方芳;重組MUC1-MBP融合蛋白疫苗抗腫瘤作用機制研究[D];吉林大學(xué);2010年

4 王秀麗;hCGβ-C3d3融合蛋白疫苗的體液免疫效應(yīng)及其抗生育潛能[D];復(fù)旦大學(xué);2004年

5 曾瑞紅;RSV重組蛋白疫苗的制備及其免疫原性和保護性研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2006年

6 章宏海;熱激蛋白HSP70融合蛋白疫苗的抗腫瘤作用研究以及HSP70在免疫調(diào)控中的作用[D];復(fù)旦大學(xué);2006年

7 譚光宏;重組異種endoglin蛋白疫苗抗腫瘤作用研究[D];四川大學(xué);2004年

8 李金耀;通過共免疫鼠卵透明帶3 DNA和蛋白疫苗技術(shù)增強免疫不孕效果及降低卵巢炎癥反應(yīng)的研究[D];新疆大學(xué);2007年

9 李曉楠;手足口病新型疫苗的初步研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 任繼玲;口蹄疫重組蛋白疫苗的計算機輔助設(shè)計及功能研究[D];吉林大學(xué);2007年

2 宋娟;可卡因—苯丙胺調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄蛋白疫苗對嗎啡誘導(dǎo)的小鼠條件性位置偏愛的影響[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2007年

3 趙莉群;重組金黃色葡萄球菌腸毒素B蛋白疫苗的制備及免疫效果評價[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2011年

4 趙明麗;DNA疫苗預(yù)敏蛋白疫苗增強策略對乙型肝炎病毒表面抗原蛋白免疫應(yīng)答的影響[D];南京醫(yī)科大學(xué);2009年

5 崔珂;CpG ODN對口蹄疫重組蛋白疫苗增效作用的研究[D];吉林大學(xué);2010年

6 黃智勇;納米氫氧化鋁吸附抗淋病LTB-PorB重組蛋白疫苗的免疫活性研究[D];南華大學(xué);2011年

7 李岱容;肺炎鏈球菌蛋白疫苗ClpP免疫保護效果的實驗研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2009年

8 戴志兵;抗淋病LTB-PorB核酸疫苗與重組蛋白疫苗聯(lián)合免疫的免疫增強效應(yīng)研究[D];南華大學(xué);2010年

9 王文洋;TAT-Ag85B蛋白疫苗輔以T-bet佐劑抗結(jié)核效應(yīng)研究[D];安徽理工大學(xué);2014年

10 姜德華;結(jié)核分枝桿菌融合蛋白疫苗（Ag85B-ESAT6）的構(gòu)建及免疫學(xué)特性研究[D];吉林大學(xué);2010年

，

本文編號：1977096