發(fā)布時間：2018-06-04 04:20

  本文選題：神經(jīng)上皮祖細(xì)胞 + 飼養(yǎng)層細(xì)胞　； 參考：《中南大學(xué)》2010年博士論文

【摘要】： 人胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cells, hESCs)從植入前囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(inner cell mass, ICM)分離而來,具有多向分化潛能和無限自我更新能力,是細(xì)胞替代治療潛在的種子細(xì)胞來源,也為人類胚胎發(fā)育機制和基因功能研究及藥物篩選等提供了新的材料。神經(jīng)退行性病由于神經(jīng)細(xì)胞的缺失或死亡后機體無法再生出新的神經(jīng)細(xì)胞替代原有細(xì)胞的功能,如帕金森病、阿爾茨海默病和亨廷頓病等,發(fā)病率高,病程緩慢,臨床上尚無有效的治療手段,hESCs來源的神經(jīng)細(xì)胞替代治療可能會為這些難治性疾病提供新的治療前景。 hESCs作為種子細(xì)胞要發(fā)揮作用,首先要建立將其定向誘導(dǎo)分化為特定細(xì)胞的誘導(dǎo)方法,在體外高效地誘導(dǎo)產(chǎn)生高純度的特定神經(jīng)細(xì)胞,并具備相應(yīng)的生物學(xué)功能。目前,hESCs誘導(dǎo)為神經(jīng)上皮細(xì)胞和神經(jīng)元的方法各有千秋,但是相互之間缺乏系統(tǒng)比較。本研究采用本所建系的多株hESCs進行體外誘導(dǎo),建立了一個簡單、高效、無血清、無動物細(xì)胞污染的神經(jīng)上皮祖細(xì)胞(neuroepithelial progenitors,NEP)和多巴胺能神經(jīng)元(dopaminergic neurons, DAN)的誘導(dǎo)體系,為研究神經(jīng)系統(tǒng)的早期發(fā)育機制和帕金森病細(xì)胞替代治療提供相應(yīng)的技術(shù)平臺和研究材料。 論文第一章的研究內(nèi)容是建立簡單高效的hESCs向神經(jīng)上皮祖細(xì)胞誘導(dǎo)體系,比較發(fā)現(xiàn)人胚胎成纖維細(xì)胞(human embryonic fibroblasts, HEF)誘導(dǎo)體系與小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonicfibroblasts, MEF)體系一樣,可以在無血清培養(yǎng)條件下使hESCs直接貼壁誘導(dǎo),產(chǎn)生具有典型rosette結(jié)構(gòu)、表達(dá)Musashi, Nestin, Pax6等特異性抗原的NEP；且HEF體系的誘導(dǎo)效率更高。與懸浮誘導(dǎo)方法相比,直接貼壁誘導(dǎo)方法的效率更高。誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加或不添加外源性的成纖維細(xì)胞生長因子2(fibroblast growth factor 2, FGF2),對于NEP的誘導(dǎo)效率沒有影響。采用無飼養(yǎng)層(feeder free, FF)可直接誘導(dǎo)出表達(dá)Musashi, Nestin和Pax6的NEP,及34%表達(dá)SSEA4的細(xì)胞。HEF和FF誘導(dǎo)體系下骨形成蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)信號通路相關(guān)基因的檢測顯示,FF體系中BMP4高表達(dá),而HEF中幾無表達(dá),提示HEF體系低BMP信號通路活性更有利于NEP的誘導(dǎo)發(fā)生。 論文第二章的研究內(nèi)容是建立HEF和FF體系產(chǎn)生的NEP的增殖擴增和向DAN誘導(dǎo)分化的體系。FGF2可以促進神經(jīng)球和貼壁的NEP的增殖擴增,且其促進作用與FGF2呈濃度依賴性關(guān)系。NEP可在體外傳6代以上,并維持相應(yīng)NEP標(biāo)記及向神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞分化的潛能。在區(qū)域特化因子成纖維細(xì)胞生長因子8(fibroblast growth factor8,FGF8)和音猬因子(sonic hedgehog, SHH)的作用下,NEP可誘導(dǎo)分化為表達(dá)Otx2和Enl的中腦DAN前體,并進一步分化為酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase, TH)陽性的DAN。HEF和FF誘導(dǎo)分化終末階段的產(chǎn)生的Tuj1和TH陽性細(xì)胞間沒有差異,且沒有SSEA4陽性細(xì)胞殘留,說明兩種體系下產(chǎn)生DAN的效率相同。FF體系不依賴于飼養(yǎng)層細(xì)胞,有利于神經(jīng)發(fā)育生物學(xué)的研究及將來神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)體系的產(chǎn)業(yè)化。 論文第三章的研究內(nèi)容是研究孤雌人胚胎干細(xì)胞(parthenogenetic human embryonic stem cells, phESCs)向NEP和DAN誘導(dǎo)分化的效率和安全性問題。和正常人胚胎干細(xì)胞(normal human embryonic stem cells, nhESCs)一樣,phESCs可產(chǎn)生的Enl,TH和Tuj1陽性細(xì)胞,提示phESCs具備相同的向DAN分化的能力。NEP的比較染色體雜交檢測未發(fā)現(xiàn)基因組染色體拷貝數(shù)的改變。印記基因H19, IGF2和Snrpn表達(dá)的檢測發(fā)現(xiàn),NEP基本維持了印記基因的表達(dá)模式。由此認(rèn)為,phESCs具備向NEP和DAN分化的能力,體外分化中維持了其染色體和印記基因表達(dá)的穩(wěn)定性,可以作為細(xì)胞替代治療的來源。 本研究通過上述結(jié)果證實,HEF體系是hESCs向NEP分化的高效誘導(dǎo)體系；FGF和BMP信號通路對于NEP的誘導(dǎo)起關(guān)鍵作用；FF體系獲得的NEP可分化為DAN; phESCs具備正常的神經(jīng)細(xì)胞分化潛能。我們建立的NEP和DAN誘導(dǎo)體系,為hESCs的臨床和基礎(chǔ)研究奠定了基礎(chǔ),為未來的神經(jīng)細(xì)胞替代治療提供了可能。
[Abstract]:Human embryonic stem cells ( hESCs ) are isolated from the inner cell mass ( ICM ) implanted into the blastocyst . It is a potential source of differentiation potential and unlimited self - renewal . It is a potential source of cell replacement therapy and provides new material for human embryonic development mechanism and gene function research and drug screening .



In vitro induction of hESCs , a simple , efficient , serum - free , non - animal cell - contaminated neuroepithelial progenitor cell ( NEP ) and dopaminergic neurons ( DAN ) were established to provide the corresponding technical platform and research material for the study of early development mechanism of nervous system and replacement therapy of Parkinson ' s disease cells .



The first part of this paper is to establish a simple and efficient induction system of hESCs to neural epithelial progenitor cells . It is found that the human embryonic fibroblasts ( HEF ) - induced system is the same as mouse embryonic fibroblasts ( MEFs ) system .
Compared with the suspension induction method , the efficiency of the direct adherent induction method is higher . The induction efficiency of the direct adherent induction method is higher . The induction efficiency of NEP is not affected by the addition or addition of exogenous fibroblast growth factor 2 ( FGF2 ) in the induction culture medium .



In the second chapter , the proliferation and amplification of NEP produced by HEF and FF systems were established .



In the third chapter , we study the efficiency and safety of the differentiation of genetic human embryonic stem cells ( phESCs ) to NEP and DAN . In normal human embryonic stem cells ( nhESCs ) , phESCs can produce Enl , TH and Tuj1 - positive cells , suggesting that phESCs has the same ability to differentiate the DNA .



In this study , the HEF system is an efficient induction system for the differentiation of hESCs to NEP .
FGF and BMP signaling pathways play a key role in the induction of NEP ;
The NEP obtained by FF system can be differentiated into DAN ; phESCs has normal nerve cell differentiation potential . We established NEP and DAN inducing system , which laid the foundation for clinical and basic research of hESCs , and provided the possibility for future neural cell replacement therapy .
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R329

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