本文選題：Ⅱ類反式激活因子 + 顯性抑制基因　； 參考：《南京醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：目的：構(gòu)建用于異種移植的新型基因改造豬,在原有的α1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(α=Gal)基因敲除以及腹膜蛋白(CD46)、血栓調(diào)節(jié)蛋白(TM)基因轉(zhuǎn)入的豬胎兒成纖維細胞基礎(chǔ)上,進一步將II類反式激活因子顯性負向(CIITA-DN)基因轉(zhuǎn)入豬的基因組,以抑制豬白細胞抗原SLA (MHC) Ⅱ類分子的表達,從而更加有效地克服多方面的免疫排斥反應(yīng)。 方法：設(shè)計合成博來霉素(Zeocin)抗性基因片段BGH-loxp-Zeo-Sv40pa-loxp,插入pMD-108T載體,再利用限制性內(nèi)切酶將其與含有CIITA-DN基因的pST205載體連接,構(gòu)建置于人Tie2增強子和CMV β-actin啟動子之下的CIITA-DN表達載體pNMU105,將線性化的pNMU105通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)入已經(jīng)敲除了α-Gal并轉(zhuǎn)入了CD46、TM基因的豬胎兒成纖維細胞181B(DKO/CD46/TM) DKO/CD46/TM轉(zhuǎn)基因的豬胎兒成纖維細胞(181B), Zeocin抗性篩選轉(zhuǎn)染pNMU105質(zhì)粒的181B細胞,PCR方法檢測CIITA-DN基因在181B細胞中的轉(zhuǎn)入,獲得陽性克隆并進行核移植,得到DKO/CD46/TM/CIITA-DN轉(zhuǎn)基因豬。取仔豬的耳組織進行基因鑒定。 結(jié)果：成功構(gòu)建pNMU105/CIITA-DN表達載體,轉(zhuǎn)入181B (DKO/CD46/TM)細胞并經(jīng)過Zeocin抗性藥物篩選獲得多株陽性單克隆,順利通過核移植得到DKO/CD46/TM/CIITA-DN轉(zhuǎn)基因豬。仔豬組織經(jīng)PCR鑒定,在592bp位置檢測到預(yù)期條帶,證明均為CIITA-DN轉(zhuǎn)基因陽性。 結(jié)論：通過數(shù)種異種移植免疫反應(yīng)相關(guān)基因的改造,在抑制超急性排斥和補體反應(yīng)、降低凝血和人CD4+T細胞免疫反應(yīng)的理論基礎(chǔ)上,得到了α-Gal基因敲除以及CD46、TM與CIITA-DN基因轉(zhuǎn)入的新型基因克隆豬。為異種器官移植中更加有效地減少免疫損傷、提高移植器官的存活率做出了新的嘗試。
[Abstract]:Objective: to construct a new type of transgenic pig for xenotransplantation, based on the original 偽 1G galactosyltransferase (偽 -galactosyltransferase) knockout and peritoneal protein CD46, thrombomodulin (TMN) gene transfer into porcine fetal fibroblasts. Furthermore, the class II transactivator CIITA-DN gene was transferred into pig genome in order to inhibit the expression of SLA class 鈪，

本文編號：1969353