本文選題：金葡菌腸毒素 + 金葡素注射液�。� 參考：《浙江大學》2009年博士論文

【摘要】： 金葡菌腸毒素由金黃色葡萄球菌分泌產(chǎn)生,是一種典型的超抗原。目前已有超過17種金葡菌腸毒素獲得了鑒定,其中包括經(jīng)典的腸毒素以及新近發(fā)現(xiàn)的多種金葡菌腸毒素。和普通抗原分子不同的是,金葡菌腸毒素分子可以以完整形式和MHC-Ⅱ分子和T細胞受體分子結(jié)合。作為目前已知的最強大的T細胞超抗原,納克甚至皮克數(shù)量級濃度的金葡菌腸毒素分子在體內(nèi)和體外均可以導致大量T細胞的增殖并促使其分泌產(chǎn)生多種細胞因子。金葡菌腸毒素的上述特征提示其可以作為一種免疫調(diào)節(jié)制劑用于人腫瘤以及相關惡性疾病的免疫治療。目前,相關臨床前研究以及臨床研究均顯示了利用基因工程制備的靶向性的金葡菌腸毒素分子極有望成為新型抗腫瘤制劑。 在國內(nèi),由金葡菌發(fā)酵濾液制備獲得的金葡素注射液作為生物反應調(diào)節(jié)劑已廣泛地應用于腫瘤疾病的治療,而相關生產(chǎn)企業(yè)聲稱其有效成分是金葡菌腸毒素C2(SEC2)。臨床報道顯示金葡素注射液具有明顯的免疫調(diào)節(jié)作用,患者在進行放化療過程中聯(lián)合使用金葡素注射液可使得CD4~+T細胞數(shù)量、CD4~+/CD8~+T細胞比例以及NK細胞數(shù)量獲得顯著提高。同時,因放化療引起的相關毒副作用如胃腸道反應、骨髓抑制等可獲得明顯的緩解。金葡素注射液的使用對腫瘤患者短期療效的提高以及生存時間的延長均具有積極的意義。但另一方面,有約20-40%的患者在使用金葡素注射液的過程中會產(chǎn)生以輕度以及中度發(fā)熱為主的不同程度的副反應,其中也包括在注射部位產(chǎn)生的紅腫、疼痛等等。 本研究利用了納升液質(zhì)聯(lián)用技術結(jié)合一向凝膠電泳技術對不同生產(chǎn)企業(yè)(沈陽協(xié)和集團有限公司,浙江省耀江藥業(yè)有限公司,杭州國光藥業(yè)有限公司,注:因涉及生產(chǎn)企業(yè)相關利益,本論文中提及的三家企業(yè)分別用企業(yè)A、企業(yè)B以及企業(yè)C代替,但文中出現(xiàn)的企業(yè)名稱在排列順序上與A、B、C無對應關系)生產(chǎn)的金葡素注射液產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)成分進行了鑒定。結(jié)果顯示,由企業(yè)A生產(chǎn)的金葡素注射液中,有超過70種金葡菌屬以及來源于其他種類革蘭氏陽性菌的蛋白質(zhì)獲得了鑒定;由企業(yè)B生產(chǎn)的金葡素注射液中有18種金葡菌屬以及來源于其他種類革蘭氏陽性菌的蛋白質(zhì)獲得了鑒定;由企業(yè)C生產(chǎn)的金葡素注射液中有12種金葡菌屬以及來源于其他種類革蘭氏陽性菌的蛋白質(zhì)獲得了鑒定。 本研究同時利用了PCR方法對某企業(yè)(注:因涉及生產(chǎn)企業(yè)相關利益,企業(yè)名稱隱去)提供的一株金葡素注射液生產(chǎn)菌株基因組中含有的金葡菌腸毒素基因分布進行了檢測。結(jié)果顯示在該生產(chǎn)菌株基因組中攜帶有七種腸毒素基因(seg,sei,sek,sem,sen,seo和seq)。我們分別克隆獲得了包括上述各種腸毒素基因以及sea、seb在內(nèi)的多種金葡菌腸毒素基因,并進行了相關多種重組金葡菌腸毒素的表達及純化。體外研究表明上述獲得的重組金葡菌腸毒素具有典型的超抗原性質(zhì),可以顯著地刺激小鼠脾淋巴細胞的增殖并增強其對腫瘤細胞生長抑制的作用。 本研究將重組金葡菌腸毒素Ⅰ免疫Balb/c小鼠以及新西蘭白兔,制備獲得了抗SEI小鼠單克隆抗體以及兔多克隆抗體。進而利用上述抗體建立了用于檢測SEI的ELISA方法并對該方法進行了優(yōu)化,結(jié)果顯示所建立的雙抗體夾心ELISA法的線性檢測范圍為0.2-7.8ng/mL,其日間精密度以及準確率分別為5.1-12.5%和82.0-112.0%,其日內(nèi)精密度以及準確率分別為5.7-13.6%和88.0-96.5%,與其他種類重組腸毒素不存在交叉反應。 另一方面,金葡菌腸毒素是唯一一種具有致嘔吐活性的超抗原。目前有相當數(shù)量的流行病學研究結(jié)果顯示在金葡菌引起的食物中毒中,SEA、SEB以及SED是最主要的幾種致病因子。但是,目前對于金葡菌腸毒素在被攝入至胃腸道后的命運以及金葡菌腸毒素如何引起食物中毒癥的機理狀仍不甚清楚。同時,金葡菌腸毒素致嘔吐活性和超抗原活性之間的關系仍然未知。本研究利用Caco-2細胞模型對重組His-SEC2分子的可能存在的跨膜作用進行了檢測。結(jié)果顯示重組His-SEC2分子可以以完整分子形式透過Caco-2單層細胞膜,且在24小時以內(nèi),無論從A側(cè)到B側(cè)或從B側(cè)到A側(cè)透過Caco-2單層細胞膜的His-SEC2的量均明顯高于陰性對照HRP的量。 1.金葡素注射液有效成分鑒定 1.1電泳分析以及膠內(nèi)酶切 將來源于三個不同企業(yè)的金葡素注射液用超濾濃縮約40倍后進行電泳分析。將凝膠染色后根據(jù)條帶濃度分割并切成小片。而后將膠碎片置于eppendorf管中進行膠內(nèi)酶切和肽段提取。 1.2納升液質(zhì)聯(lián)用分析 將樣品用上樣緩沖液溶解、超聲,而后進行納升液質(zhì)聯(lián)用分析。利用三重四級桿線性離子阱質(zhì)譜獲得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)用Mascot 1.9軟件針對革蘭氏陽性菌數(shù)據(jù)庫進行搜索。 2.金葡素注射液生產(chǎn)菌株中金葡菌腸毒素基因檢測和多種重組金葡菌腸毒素的制備及其超抗原活性檢測 2.1金葡菌腸毒素基因檢測以及重組金葡菌腸毒素的制備 利用PCR方法對某企業(yè)提供的一株金葡素注射液生產(chǎn)菌株基因組中的腸毒素基因分布進行檢測。而后將由PCR獲得的多種編碼金葡菌腸毒素的基因克隆至pGEX-4T-1質(zhì)粒構建重組金葡菌腸毒素表達質(zhì)粒。而后利用大腸桿菌BL21表達帶有GST標簽的重組金葡菌腸毒素。利用親和層析純化帶有GST標簽的重組金葡菌腸毒素,用凝血酶將GST標簽去除后利用陰離子層析對重組金葡菌腸毒素進行純化。 2.2重組金葡菌腸毒素的超抗原活性檢測 利用MTT法對金葡菌腸毒素刺激小鼠淋巴細胞增殖的作用進行檢測。通過增殖指數(shù)計算重組金葡菌腸毒素對小鼠淋巴細胞的刺激強度。同樣利用MTT法,以K562-ADM細胞作為靶細胞,對受重組金葡菌腸毒素刺激的小鼠淋巴細胞抑制腫瘤細胞生長的作用進行檢測。另外,以A549作為靶細胞,利用實時細胞電子分析系統(tǒng)對受重組SEI刺激的小鼠淋巴細胞抑制腫瘤細胞生長的作用進行檢測。 3.SEI免疫檢測方法的建立 3.1兔抗SEI單克隆抗體和鼠抗SEI單克隆抗體的制備 新西蘭大白兔背部皮下注射純化的重組SEI進行多次免疫,約八周后收集抗SEI血清。Balb/c小鼠背部皮下注射純化的重組SEI進行免疫,在細胞融合前三天進行沖擊免疫。而后利用聚乙二醇4000將免疫小鼠的脾淋巴細胞與小鼠SP2/0骨髓瘤細胞進行融合。用間接ELISA和有限稀釋法對可產(chǎn)生抗SEI抗體的雜交瘤細胞進行篩選和克隆擴增。將獲得的陽性雜交瘤細胞株腹腔注射經(jīng)石蠟油致敏的Balb/c小鼠,10-14天后收集腹水并用辛酸-硫酸銨法純化抗SEI單克隆抗體。 3.2 ELISA檢測方法的建立 對兩種ELISA方法進行了考察:(1)兔抗SEI多克隆抗體作為包被抗體,鼠抗SEI單克隆抗體作為第二抗體;(2)鼠抗SEI單克隆抗體作為包被抗體,兔抗SEI多克隆抗體作為第二抗體。同時,對包被抗體、第二抗體濃度以及其他工作條件進行了優(yōu)化。 4.His-SEC2的跨膜作用 以辣根過氧化物酶作為非特異性跨膜的陰性對照,利用生長在Transwell~(TM)板上的單層Caco-2細胞對重組His-SEC2的跨膜作用進行檢測。His-SEC2加入至Transwell~(TM)板的A側(cè)或B側(cè),經(jīng)過孵育后,根據(jù)His-SEC2加入的位置收集B側(cè)或者A側(cè)的培養(yǎng)基。而后利用實驗室先前建立的ABS-ELISA方法對樣品溶液中His-SEC2的含量進行檢測,同時利用Western-blotting方法對其中的His-SEC2進行檢測。 結(jié)論 本研究利用液質(zhì)聯(lián)用偶聯(lián)SDS凝膠電泳對三種金葡素注射液中的蛋白質(zhì)成分進行了鑒定。結(jié)果顯示,從三種針劑中有多種金葡菌屬以及其他革蘭氏陽性菌屬蛋白質(zhì)獲得了鑒定。在今后的工作中,需要對鑒定獲得的蛋白質(zhì)與金葡素注射液的臨床療效或毒副作用之間的關系進行進一步研究。同時,質(zhì)譜提示現(xiàn)有的金葡素注射液制備生產(chǎn)工藝以及質(zhì)量控制標準需要進行進一步的改進和提高以規(guī)范生產(chǎn)工藝、避免菌株污染、減少共存雜質(zhì)、提高臨床療效。本研究對其中一家企業(yè)提供的生產(chǎn)菌株中腸毒素基因分布進行檢測,結(jié)果顯示其中含有七種腸毒素基因,因此提示上述七種金葡菌腸毒素的一種或者幾種可能存在于相關金葡素注射液產(chǎn)品中。本研究利用基因工程的方法制備獲得了包括上述七種金葡菌腸毒素在內(nèi)的多種重組金葡菌腸毒素,結(jié)果顯示獲得的重組金葡菌腸毒素在體外具有與天然SEC2相近的超抗原活性,因此,利用基因工程方法獲得的重組金葡菌腸毒素為制備新一代金葡素注射液提供了一種嶄新的選擇。本研究還制備獲得了抗SEI小鼠單克隆抗體和兔多克隆抗體,并在此基礎上建立了ELISA夾心法用于微量SEI的檢測,可應用于今后相關疾病的臨床診斷和相關產(chǎn)品的生產(chǎn)研發(fā)。 目前對于金葡菌腸毒素在人胃腸道內(nèi)的命運以及產(chǎn)生腸道活性的作用機制仍然有待進一步研究。本研究對重組His-SEC2的跨膜作用進行了初步研究,結(jié)果顯示完整的重組His-SEC2分子可以以一種特異的方式透過Caco-2單層細胞膜,該結(jié)果提示SEC2以及其他種類的金葡菌腸毒素可能可以透過小腸上皮細胞從而引起局部或全身性癥狀的產(chǎn)生。同時,上述結(jié)果也提示了今后研制以金葡菌腸毒素為有效成分的口服制劑的可能性。 綜上所述,本研究對現(xiàn)有的金葡素注射液產(chǎn)品中的蛋白類成分以及重組金葡菌腸毒素的超抗原活性進行了初步的探索和研究,建立了針對SEI的免疫學檢測方法,對重組His-SEC2的跨膜作用進行了初步的研究,為今后金葡菌腸毒素研究工作的開展建立了一定的基礎。
[Abstract]:Staphylococcus aureus enterotoxins are produced by staphylococcus aureus secretion , and is a typical superantigen . More than 17 kinds of staphylococcus aureus enterotoxins have been identified , including classical enterotoxins and recently discovered various kinds of Staphylococcus aureus enterotoxins . Unlike common antigen molecules , the staphylococcus aureus enterotoxins can be combined with MHC - II molecules and T cell receptor molecules .



The clinical report shows that the injection of gold - glucose injection has obvious immunoregulation effect , and the use of gold - glucoside injection can make the number of CD4 ~ + T cells , CD4 ~ + / CD8 ~ + T - cell ratio and NK cell count .



The results showed that there were more than 70 kinds of Staphylococcus aureus and proteins derived from other kinds of Gram - positive bacteria .



This study also used the PCR method to detect the gene distribution of Staphylococcus aureus Enterotoxin contained in the genome of a strain of Staphylococcus aureus , which was supplied by a certain enterprise ( Note : Due to the relevant interests of the production enterprise and the name of the enterprise ) . The results showed that the genome of the production strain was carried with seven kinds of enterotoxin genes . In vitro studies have shown that the above - mentioned recombinant Staphylococcus aureus Enterotoxin has typical superantigen properties , which can significantly stimulate the proliferation of mouse spleen lymphocytes and enhance its effect on tumor cell growth inhibition .



The anti - SEI mouse monoclonal antibody and rabbit polyclonal antibody were prepared by immunizing Balb / c mice and New Zealand white rabbits . The ELISA method for detecting SEI was established and optimized . The results showed that the linear detection range of the established double - antibody sandwich ELISA was 0.2 - 7.8 ng / mL . The precision and accuracy of the antibody were 5.7 - 13.6 % and 88.0 - 96.5 % , respectively , and no cross - reaction with other kinds of recombinant enterotoxins .



The results show that the recombinant His - SEC2 molecule can penetrate Caco - 2 monolayer cell membrane in the form of intact molecule , and the amount of His - SEC2 through Caco - 2 monolayer cell membrane from side A to B side or from side B to side A is significantly higher than that of negative control HRP .



1 . Identification of the effective components of Jinglucoside injection



1.1 electrophoretic analysis and in - gel enzyme digestion



The gold - glucose injection from three different enterprises was subjected to electrophoretic analysis by ultrafiltration concentration of about 40 times . The gel was stained and cut into pieces according to the band concentration . Then , the gel fragments were placed in an epp tube to perform an in - gel enzyme digestion and peptide segment extraction .



1.2 Natto - liquid mass spectrometry



The samples were dissolved in a sample buffer , followed by nanoliter liquid chromatography . The mass spectrum data obtained by using the triple quadrupole linear ion trap mass spectrometry was searched for Gram - positive bacteria databases using the Mascot 1.9 software .



Detection of Staphylococcus aureus Enterotoxin Gene and Preparation of Various Recombinant Staphylococcus aureus Enterotoxin and Detection of Its Superantigen Activity



2.1 Detection of Enterotoxin Gene of Staphylococcus aureus and Preparation of Recombinant Staphylococcus aureus Enterotoxin



A recombinant S . aureus Enterotoxin with GST tag was constructed by affinity chromatography , and the recombinant S . aureus was purified by thrombin .



2.2 Detection of Superantigen Activity of Recombinant Staphylococcus aureus Enterotoxin



In addition , A549 cells were used as target cells to detect the growth of tumor cells in lymphocytes stimulated by recombinant Staphylococcus aureus Enterotoxin . In addition , A549 cells were used as target cells to detect the growth of tumor cells by using real - time cellular electronic analysis system .



3 . Establishment of SEI Immunodetection Method



3.1 Preparation of Rabbit Anti - SEI Monoclonal Antibody and Mouse Anti - SEI Monoclonal Antibody



Balb / c mice were injected into Balb / c mice sensitized by paraffin oil for 10 - 14 days , and the anti - SEI monoclonal antibody was purified by means of an indirect ELISA and a limited dilution method .



3.2 Establishment of ELISA Test Method



Two ELISA methods were investigated : ( 1 ) the rabbit anti - SEI polyclonal antibody was used as the coating antibody , the mouse anti - SEI monoclonal antibody was used as the second antibody ; ( 2 ) the mouse anti - SEI monoclonal antibody was used as the coating antibody and the rabbit anti - SEI polyclonal antibody was used as the second antibody . Meanwhile , the antibody , the second antibody concentration and the other working conditions were optimized .



4 . Transmembrane Effect of His - SEC2



The cross - membrane interaction of His - SEC2 was detected by using a single layer of Caco - 2 cells grown on the Transwell ~ ( TM ) plate . His - SEC2 was added to the A - side or B - side of Transwell ~ ( TM ) plate . After incubation , the contents of His - SEC2 in the sample solution were detected according to the position of His - SEC2 , and the His - SEC2 was detected by Western - blotting .



Conclusion



The results showed that there were seven kinds of recombinant strains of Staphylococcus aureus and other Gram - positive bacteria . The results showed that there were seven kinds of recombinant strains of Staphylococcus aureus and other Gram - positive bacteria .



The results show that the complete recombinant His - SEC2 molecule can penetrate the Caco - 2 monolayer cell membrane in a specific way , suggesting that the intact recombinant His - SEC2 molecule can penetrate the small intestine epithelial cells to induce local or systemic symptoms .



In conclusion , this study has carried out a preliminary exploration and research on the protein components and the superantigen activity of recombinant Staphylococcus aureus Enterotoxin , and established an immunological detection method for SEI . The cross - membrane effect of recombinant His - SEC2 was studied .
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R392

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本文編號：1963149