本文選題：葡萄糖轉(zhuǎn)運子4 + 收縮��； 參考：《天津醫(yī)科大學》2009年碩士論文

【摘要】：肌肉是動物機體利用葡萄糖最重要的組織,其糖代謝是維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要基礎(chǔ),大量的研究集中在胰島素刺激葡萄糖轉(zhuǎn)運的信號轉(zhuǎn)導通路上。胰島素和運動均促使葡萄糖轉(zhuǎn)運子4轉(zhuǎn)位到細胞膜上,轉(zhuǎn)運更多的葡萄糖進入細胞而調(diào)節(jié)細胞的葡萄糖攝取量。普遍認為,胰島素和運動引發(fā)的葡萄糖轉(zhuǎn)運機制是完全不同的,胰島素激發(fā)的葡萄糖轉(zhuǎn)運主要依賴于P13K的激活,而運動導致的糖攝取則可能有Ca2+和AMPK的參與。相對于胰島素,對運動/肌肉收縮刺激骨骼肌攝取葡萄糖的機制了解較少。 目前研究運動/肌肉收縮多應用轉(zhuǎn)基因動物,但成本高,操作復雜。而應用培養(yǎng)的細胞株則沒有諸多限制,費用較低,并可單獨分析細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導。 本研究的目的是應用穩(wěn)定過表達GLUT4myc的能收縮的C2C12GLUT4myc小鼠骨骼肌細胞模型探討運動/肌肉收縮刺激骨骼肌細胞GLUT4運輸機制中AMPK和CaMKⅡ的作用。 方法： 第一部分確定C2C12GLUT4myc細胞的培養(yǎng)和分化條件。測定此細胞的GLUT4myc轉(zhuǎn)位響應Carbachol刺激的時間曲線,并用Western blot法檢測Carbachol對AS160的調(diào)節(jié)作用。 第二部分測定在Carbacho1刺激下骨骼肌細胞內(nèi)Ca2+濃度的變化。 第三部分在AMPK和CaMKⅡ的特異性藥物抑制劑存在的條件下,測定收縮刺激GLUT4myc轉(zhuǎn)位,并用Western blot法檢測高鉀溶液和Carbachol對ACC、 AMPK、CaMKⅡ和CaMKⅠ的調(diào)節(jié)作用,研究AMPK和CaMKⅡ在收縮刺激GLUT4myc轉(zhuǎn)位中的作用。 結(jié)果： 第一部分比較不同濃度Carbachol刺激的C2C12GLUT4myc肌管GLUT4myc轉(zhuǎn)位,結(jié)果顯示,C2C12GLUT4myc細胞的GLUT4myc轉(zhuǎn)位對Carbachol的作用呈劑量和時間依賴關(guān)系。0.1mM和1mM的Carbachol刺激均增加細胞表面GLUT4myc含量,0min為基礎(chǔ)狀態(tài),0.1mM Carbachol刺激20min使GLUT4myc轉(zhuǎn)位達最大值,為基礎(chǔ)狀態(tài)的(1.91±0.41)倍(p0.05)；1mM Carbachol刺激10min使GLUT4myc轉(zhuǎn)位達最大值,為基礎(chǔ)狀態(tài)的(2.00±0.14)倍(p0.05)。 第二部分用激光共聚焦顯微鏡測定在Carbachol和Caffeine刺激下骨骼肌細胞內(nèi)Ca2+濃度的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)1mM Carbachol刺激使胞漿內(nèi)Ca2+濃度急性上升,然后緩慢下降并長時間維持在一個較高的濃度：0.1mM Carbachol使細胞內(nèi)Ca2+濃度呈上下波動趨勢；1μM Carbachol使細胞內(nèi)Ca2+急性上升并快速下降,然后維持在基礎(chǔ)水平。3mM Caffeine使細胞內(nèi)Ca2+濃度急性上升,并下降到一定水平后維持；5mM Caffeine使細胞內(nèi)Ca2+到一較高水平,然后下降,.并呈上下波動趨勢。 第三部分在AMPK和CaMKⅡ的特異性藥物抑制劑存在的條件下,測定收縮刺激GLUT4myc轉(zhuǎn)位,并用Western blot法檢測高鉀溶液和Carbachol對ACC、 AMPK、CaMKⅡ和CaMKⅠ的調(diào)節(jié)作用,研究AMPK和CaMKⅡ在收縮刺激GLUT4myc轉(zhuǎn)位中的作用。發(fā)現(xiàn)：1mM Carbachol刺激20min可增加C2C12GLUT4myc肌管的GLUT4myc轉(zhuǎn)位,10μM的CaMKⅡ抑制劑KN93預孵育30min,可抑制69%的Carbachol刺激的GLUT4myc轉(zhuǎn)位(p0.05)。CaMKK抑制劑STO-609預孵育不影響Carbachol刺激的GLUT4myc轉(zhuǎn)位。50μM骨骼肌肌球蛋白ATPase抑制劑(BTS)預孵育30min,可抑制37%的Carbachol刺激的GLUT4myc轉(zhuǎn)位(p0.05)。與文獻報道的一致,AMPK的抑制劑Compound C(CC)抑制了71%的Carbachol刺激的GLUT4myc轉(zhuǎn)位(p0.05)。 Western blot檢測細胞裂解液ACCpS79、AMPKpT172、CaMK II pT289、CaMK IpT177。研究結(jié)果表明,高鉀溶液、Carbachol和Caffeine刺激均能增加C2C12GLUT4myc肌管CaMKⅡ的磷酸化水平；高鉀溶液和Carbachol均可顯著刺激AMPK的磷酸化,但不影響CaMKK的下游分子CaMKⅠ的磷酸化。AICAR和Carbachol使C2C12GLUT4myc肌管ACC活性增強,AMPK的抑制劑Compound C預先孵育細胞抑制此作用；AICAR和Carbachol均使AMPK活性增強,但Compound C不抑制此作用。BTS抑制Carbachol刺激的C2C12GLUT4myc肌管AMPK活性增強,不抑制AICAR刺激的C2C12GLUT4myc肌管AMPK活性增強。 結(jié)論： 1.可收縮的C2C12GLUT4myc骨骼肌細胞的GLUT4myc轉(zhuǎn)位對不同濃度Carbachol作用呈劑量和時間依賴關(guān)系；細胞響應Carbachol刺激的收縮作用,GLUT4myc轉(zhuǎn)位到細胞膜。 2. Carbachol和Caffeine刺激均能增加胞內(nèi)Ca2+水平,最高分別可達基礎(chǔ)狀態(tài)的3.5倍和2.5倍。 3.高鉀和Carbachol去極化誘發(fā)的收縮刺激骨骼肌細胞GLUT4myc轉(zhuǎn)位,其信號轉(zhuǎn)導機制不同于胰島素,參與的信號分子可能涉及AMPK。表明肌肉收縮可替代胰島素促進骨骼肌攝取葡萄糖。Ca2+敏感的與收縮有關(guān)的信號機制不需要CaMKK,可能需要CaMKⅡ。本課題應用研究肌肉收縮刺激骨骼肌攝取葡萄糖機制的C2C12GLUT4myc骨骼肌細胞模型,測定了GLUT4轉(zhuǎn)位對高鉀和Carbachol刺激的收縮的響應,探討了CaMKⅡ和AMPK等信號分子在收縮刺激GLUT4myc轉(zhuǎn)位的信號轉(zhuǎn)導中的作用機制,可為藥物研發(fā)提供作用靶點,有助于臨床干預、改善胰島素抵抗。
[Abstract]:Muscle is the most important tissue for the use of glucose in animal body, and its glucose metabolism is an important basis for maintaining the stability of the environment in the body. A large number of studies are focused on the signal transduction pathway that insulin stimulates glucose transport. Insulin and exercise promote the translocation of glucose transporter 4 to the cell membrane and transport more glucose into the cell. It is generally believed that the glucose transport mechanism caused by insulin and exercise is completely different. Insulin stimulated glucose transport is mainly dependent on the activation of P13K, while exercise induced glucose uptake may be involved in Ca2+ and AMPK. The mechanism of glucose is less known.
There is a high cost and complex operation in the study of exercise / muscle contraction, but the use of cultured cell lines is not limited, and the cost is low, and the intracellular signal transduction can be analyzed separately.
The purpose of this study is to explore the role of AMPK and CaMK II in the GLUT4 transport mechanism of skeletal muscle cells stimulated by the contractile C2C12GLUT4myc mouse skeletal muscle cell model which is stable over expression of GLUT4myc.
Method錛，

本文編號：1957501