本文選題：組蛋白賴氨酸脫甲基酶 + ES細胞��； 參考：《復旦大學》2009年博士論文

【摘要】：組蛋白賴氨酸脫甲基酶Lsd1 (Lysine specific demethylase 1)催化H3K4me1/2或H3K9mel/2脫甲基化從而調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與基因轉(zhuǎn)錄。隨著表觀遺傳學的飛速發(fā)展,人們已經(jīng)認識到表觀遺傳調(diào)控在發(fā)育分化與疾病發(fā)生中起著重要的作用。組蛋白賴氨酸甲基化與脫甲基化介導的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控是發(fā)育分化過程中表觀遺傳調(diào)節(jié)的重要部分,然而Lsd1在其中的具體作用尚不清楚。因此,我們分別以小鼠胚胎干細胞(embryonic stem cells, ES cells)與斑馬魚為體外和體內(nèi)模型,采用RNA干擾、Morpholino反義核酸、化學抑制劑處理、基因芯片、染色質(zhì)免疫沉淀等實驗技術(shù)研究Lsdl在發(fā)育分化中的作用。 我們采用慢病毒介導的shRNA在小鼠ES細胞中成功的下調(diào)了Lsdl的表達,結(jié)果顯示：①下調(diào)Lsd1表達不影響ES細胞的自我更新：細胞形態(tài)以及多能性標志基因Oct4、Nanog、Sox2與Rexl的表達水平未發(fā)生顯著改變。②在EB(embryonic body,擬胚體)分化過程中加入Lsd1的H3K4mel/2脫甲基酶活性抑制劑TCP (Tranylcypromine,反式環(huán)苯丙胺),紅細胞標志基因Globin等的表達被顯著抑制,但內(nèi)皮細胞標志基因VE-Cadherin等的表達沒有變化,胚胎早期發(fā)育相關(guān)基因的表達也沒有明顯變化。③下調(diào)Lsdl表達顯著抑制EB分化過程的中胚層細胞發(fā)育分化：早期中內(nèi)胚層標志基因Brachyury的表達被延遲,造血/內(nèi)皮祖細胞標志基因Flkl、造血祖細胞標志基因Scl、紅系祖細胞標志基因Gatal及紅細胞標志基因Globin等的表達被顯著抑制。④染色質(zhì)免疫沉淀檢測顯示EB分化過程中Lsd1可以結(jié)合在cKit基因的啟動子區(qū)域,TCP處理引起EB10天時造血相關(guān)基因啟動子區(qū)域H3K4me2水平上升。⑤基因芯片檢測結(jié)果顯示下調(diào)Lsd1表達導致中胚層發(fā)育延遲,早期中胚層標志基因在EB6天仍然高表達。我們的研究結(jié)果證明Lsd1調(diào)節(jié)胚胎早期的發(fā)育分化,其中對原始造血分化的調(diào)節(jié)作用依賴于H3K4mel/2脫甲基酶活性。 以斑馬魚為模型的實驗結(jié)果顯示：①TCP處理的斑馬魚胚胎在30 hpf時出現(xiàn)“無血(Bloodless)"表型,而用帕吉林(Pargyline)和丙酰芐胺異煙肼(Nialamide)處理則不引起類似表型。②進一步檢測顯示TCP抑制原始紅細胞生成,但對血管發(fā)生沒有顯著影響；TCP處理的Tg (gatal:EGFP)斑馬魚胚胎在30 hpf時血液循環(huán)中EGFP陽性細胞數(shù)目減少,并且胚胎globin基因表達減少。③克隆表達純化了zLsd1的C端161-867a.a.(含SWIRM與FAD結(jié)構(gòu)域,GST-zLsd1161-867aa),脫甲基酶活性測試顯示體外重組表達的GST-zLsdl 161-867a.a具有H3K4me2脫甲基酶活性,并且TCP可以抑制體外重組表達的GST-zLsd1161-867aa對H3K4me2的脫甲基酶活性。④注射干擾zLsd1 mRNA正常剪接的反義核酸(lsd1-MO)也導致斑馬魚胚胎在30 hpf時出現(xiàn)“無血”表型、血液循環(huán)中g(shù)ata1:EGFP陽性細胞數(shù)目減少,胚胎globin基因表達減少。⑤基因芯片檢測結(jié)果顯示注射lsd1-MO的斑馬魚胚胎在24hpf時胚胎globin基因的表達均被抑制,其它一些紅細胞相關(guān)標志基因的表達也被抑制。 我們在兩種生物學模型中的研究結(jié)果均表明Lsd1在胚胎發(fā)育與細胞分化中發(fā)揮著重要的作用：Lsdl調(diào)節(jié)中胚層發(fā)育分化及原始紅細胞生成。Lsd1對早期中胚層發(fā)育分化的作用不依賴于H3K4me1/2脫甲基酶活性,但對原始紅細胞生成的調(diào)節(jié)作用主要依賴于H3K4me1/2脫甲基酶活性。Lsd1調(diào)節(jié)不同階段發(fā)育分化的具體機制以及在血液等相關(guān)疾病中作用還有待進一步研究。
[Abstract]:Histone lysine demethanase Lsd1 (Lysine specific demethylase 1) catalyzes the demethylation of H3K4me1/2 or H3K9mel/2 to regulate chromatin structure and gene transcription. With the rapid development of epigenetics, it has been recognized that epigenetic regulation plays an important role in the development of differentiation and disease. Histone lysine Methylation and demethylation mediated gene transcription regulation is an important part of epigenetic regulation during developmental differentiation. However, the specific role of Lsd1 is not clear. Therefore, we use mouse embryonic stem cells (embryonic stem cells, ES cells) and zebrafish as in vitro and in vivo models, using RNA interference, Morpholino reaction. The role of Lsdl in the development and differentiation was studied by using nucleic acid, chemical inhibitor, gene chip and chromatin immunoprecipitation.
The expression of Lsdl was downregulated by lentivirus mediated shRNA in mouse ES cells. The results showed that: (1) downregulation of Lsd1 expression did not affect the self renewal of ES cells: cell morphology and pluripotent marker gene Oct4, the expression level of Nanog, Sox2 and Rexl had not changed significantly. 2. In EB (embryonic body, the embryoid body) The expression of Lsd1 H3K4mel/2 demethylase activity inhibitor TCP (Tranylcypromine, trans ring amphetamine) and erythrocyte marker gene Globin were significantly inhibited during the process, but the expression of the endothelial cell marker gene VE-Cadherin and so on did not change, and the expression of the early embryonic development related genes had not changed obviously. (3) down regulated Lsdl expression. The development and differentiation of mesoderm cells in the EB differentiation process: the expression of the early mesoderm marker gene Brachyury was delayed, the hematopoietic / endothelial progenitor marker gene Flkl, the hematopoietic progenitor marker gene Scl, the erythroid progenitor cell marker gene Gatal and the erythrocyte marker gene Globin were significantly suppressed. The detection showed that Lsd1 could be combined with the promoter region of the cKit gene during the differentiation of EB. TCP treatment caused the increase of H3K4me2 level in the promoter region of hematopoietic related genes at EB10 days. 5. The results of gene chip detection showed that the down-regulation of Lsd1 expression led to the delayed development of mesoderm, and the early mesoderm gene was still highly expressed in EB6 days. The results showed that Lsd1 regulates the differentiation and development of early embryos, and its regulation on primitive hematopoietic differentiation depends on the activity of H3K4mel/2 demethylation.
The experimental results of zebrafish model showed that: (1) TCP treated zebrafish embryos had "Bloodless" phenotypes at 30 HPF and no similar phenotype was caused by the treatment of Bloodless (Pargyline) and propanylbenzamine isoniazid (Nialamide). 2. Further tests showed that TCP inhibited the formation of original red blood cells, but there was no significant effect on blood vessels. The number of EGFP positive cells in the blood circulation of Tg (gatal:EGFP) zebrafish treated by TCP decreased and the expression of globin gene decreased. (3) the clone expressed and purified 161-867a.a. (SWIRM and FAD domain, GST-zLsd1161-867aa) and purified the C end of zLsd1, and the demethylation activity test showed that the recombinant expression of zLsd1 was 16. 1-867a.a has H3K4me2 demethylation activity, and TCP can inhibit the reorganized GST-zLsd1161-867aa demethase activity of H3K4me2 in vitro. (4) injecting zLsd1 mRNA normal splicing antisense nucleic acid (lsd1-MO) also leads to the appearance of "blood free" phenotype in zebrafish embryos at 30 HPF, and the number of gata1:EGFP positive cells in blood circulation. The expression of globin gene decreased. 5. The results of gene chip detection showed that the expression of globin gene in the embryo of zebrafish injection of lsd1-MO was suppressed at 24hpf, and the expression of some other erythrocyte related genes was also suppressed.
Our results in two biological models show that Lsd1 plays an important role in embryonic development and cell differentiation: Lsdl regulates the development and differentiation of mesoderm and the effect of.Lsd1 on the development and differentiation of the early mesoderm does not depend on the activity of the H3K4me1/2 demethase, but the regulation of the formation of the original erythrocyte The specific mechanisms that mainly rely on the H3K4me1/2 demethylase activity.Lsd1 to regulate the development and differentiation of different stages and the role in the blood related diseases need to be further studied.
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R329

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本文編號：1953483