本文選題：VASP + PDGF��； 參考：《武漢大學(xué)》2010年博士論文

【摘要】：細胞遷移(Cell migration)參與正常的生理過程,如胚胎的形成、組織修復(fù)和再生,也與多種重要病理過程有關(guān),如血管疾病、癌癥等。因此,研究細胞遷移的基本機制對相關(guān)疾病的治療十分重要。 細胞移動的過程直接以細胞骨架的改建為基礎(chǔ),在肌動蛋白聚合和解聚的反應(yīng)上發(fā)生。血管擴張刺激磷蛋白(Vasodilator-stimulated phosphoprotein, VASP)是PKA的一種重要作用底物,它調(diào)節(jié)肌動蛋白絲的組裝和集聚,在與肌動蛋白骨架調(diào)節(jié)有關(guān)的各種細胞功能中發(fā)揮重要作用。但是,VASP磷酸化在細胞遷移中的確切作用還不完全清楚。而且,PKA如何將細胞外信號特異性傳遞到細胞內(nèi)VASP從而引起細胞移動呢,其信號通路的具體調(diào)節(jié)機制尚不明確。 最新研究表明,激酶A錨定蛋白(A-kinase anchoring proteins, AKAPs)介導(dǎo)了PKA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的特異性調(diào)節(jié)。AKAPs與PKA結(jié)合,引導(dǎo)并錨定PKA于細胞內(nèi)的特定區(qū)域,使PKA催化活性充分激活,從而定向地使該處底物磷酸化來發(fā)揮特定的生物學(xué)效應(yīng)。WAVE-1是定位于肌動蛋白骨架的一種特殊的AKAPs蛋白,參與了Rac信號介導(dǎo)的板狀偽足的形成。因此,我們探討WAVE-1錨定結(jié)合PKA對細胞遷移的影響及對PKA-VASP信號途徑的調(diào)節(jié)作用。 本研究以VASP磷酸化在PDGF誘導(dǎo)細胞遷移中的調(diào)節(jié)作用為切入點,采用離體細胞實驗和在體動物模型,觀察WAVE-1對PKA-VASP通路的調(diào)控,旨在進一步明確VASP磷酸化對細胞遷移的確切機制,為細胞移動障礙相關(guān)疾病的治療提供理論依據(jù)和新的治療靶點。具體研究內(nèi)容分為以下四個部分。 第一部分VASP的磷酸化及其磷酸化位點突變對細胞遷移的影響 目的：VASP磷酸化是調(diào)節(jié)其自身功能的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。VASP有三個磷酸化位點Ser157, Ser239及Thr278,分別受到PKA/PKG的信號調(diào)節(jié)。這些位點的磷酸化與VASP功能的調(diào)節(jié)密切相關(guān)。本實驗通過觀察VASP在PDGF誘導(dǎo)細胞遷移中的表達和分布,及VASP Ser157和Ser239位點突變對細胞遷移的影響,探討VASP磷酸化在細胞遷移中的作用及各磷酸化位點的確切作用。 方法：1. PDGF誘導(dǎo)細胞發(fā)生遷移,采用細胞劃痕損傷實驗和Giemsa染色觀察遷移情況；采用Western blot法檢測VASP總蛋白表達和VASP Ser157磷酸化的表達量;用免疫熒光檢測遷移細胞內(nèi)肌動蛋白骨架和VASP的分布情況。 2.將VASP Ser157和Ser239磷酸化位點突變體及VASP對照質(zhì)粒分別用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染ECV304細胞株,轉(zhuǎn)染24-48小時后用Western blot法分別檢測VASP磷酸化位點突變效果,通過transwell小室跨膜遷移實驗觀察各實驗組對PDGF誘導(dǎo)20h后細胞遷移的影響。 結(jié)果：1.PDGF誘導(dǎo)細胞向劃痕區(qū)域發(fā)生明顯遷移,遷移前緣的細胞向前方伸長,形成寬大的細胞突起結(jié)構(gòu)。免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn),PDGF刺激細胞骨架發(fā)生重排,細胞內(nèi)出現(xiàn)粗大的肌動蛋白纖維絲,主要分布于沿遷移方向伸出的片狀偽足上。VASP也由散在的點狀分布轉(zhuǎn)移到肌動蛋白纖維絲的末端,大部分聚集在細胞片狀偽足的前緣。遷移細胞內(nèi)VASP的總蛋白表達增加,VASP Ser157磷酸化水平增高。 2.轉(zhuǎn)染VASP Ser157位點突變體的ECV304細胞內(nèi),VASP Ser157磷酸化表達顯著減少,VASP Ser239磷酸化表達無明顯變化。轉(zhuǎn)染VASP Ser239位點突變體的ECV304細胞內(nèi),VASP Ser239磷酸化表達顯著減少,VASP Ser157磷酸化表達無明顯變化�？缒みw移實驗結(jié)果顯示,分別轉(zhuǎn)染這兩種突變體的ECV304細胞跨膜遷移的數(shù)量都明顯減少,但VASP Ser157突變體轉(zhuǎn)染組與Ser239突變體轉(zhuǎn)染組的的遷移細胞數(shù)量無明顯差異性。 結(jié)論：1.VASP磷酸化正向調(diào)控細胞遷移2.VASP Ser157和Ser239位點磷酸化均介導(dǎo)細胞遷移。 第二部分PKA和AKAP對PDGF誘導(dǎo)的細胞遷移的調(diào)控作用 目的：本實驗通過抑制AKAP與PKA的結(jié)合及PKA活性對PDGF誘導(dǎo)的細胞骨架和細胞遷移的影響,旨在探討AKAP和PKA對PKA-VASP信號途徑及細胞遷移的調(diào)節(jié)作用。 方法：將ECV304細胞分為四組：空白對照組,PDGF誘導(dǎo)遷移組(PDGF), PKARⅡ-AKAP特異性結(jié)合抑制劑St-Ht31+PDGF組,PKA選擇性抑制劑H-89+PDGF組。采用細胞劃痕損傷實驗觀察細胞遷移,用非放射性酶法檢測PKA活性,采用western blot檢測VASP Ser157磷酸化的表達量。用免疫熒光檢測各組細胞肌動蛋白骨架和VASP的分布情況。 結(jié)果：1.PDGF誘導(dǎo)ECV304細胞發(fā)生明顯的遷移。經(jīng)PDGF處理的細胞PKA活性增強,VASP Ser157磷酸化水平增高。PKA選擇性抑制劑H-89能顯著抑制PDGF誘導(dǎo)的細胞遷移,抑制PKA活性,降低VASP Ser157磷酸化水平。PKARⅡ-AKAP特異性結(jié)合抑制劑St-Ht31也能顯著抑制PDGF誘導(dǎo)的細胞遷移,降低PKA活性,降低VASP Ser157磷酸化。 2.免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)預(yù)先用AKAP-PKA結(jié)合抑制劑St-Ht31處理后再用PDGF刺激細胞,細胞內(nèi)沒有片狀偽足形成,肌動蛋白纖維絲明顯減少,但仍有少量肌動蛋白纖維絲向不同方向伸展。VASP呈現(xiàn)散在分布,部分VASP分布在肌動蛋白纖維絲的末端。而預(yù)先用PKA活性抑制劑H-89處理后再用PDGF刺激的細胞內(nèi),細胞骨架被破壞,肌動蛋白纖維絲基本消失。VASP表達量明顯減少,零星地散在分布于細胞漿中。 結(jié)論：1.抑制PKA活性可破壞細胞骨架,抑制PDGF誘導(dǎo)的細胞遷移。2.抑制AKAP和PKA結(jié)合可抑制片狀偽足形成,抑制PKA活性和VASP磷酸化,從而抑制PDGF誘導(dǎo)的細胞遷移。 第三部分WAVE-1對細胞遷移調(diào)節(jié)機制的探討 目的：WAVE-1蛋白是定位于細胞骨架的一種特殊的AKAP家族成員,它轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞外信號并整合PKA與細胞骨架調(diào)節(jié)分子來調(diào)節(jié)細胞移動。本實驗通過建立WAVE-1穩(wěn)定過表達細胞株,探討它對PDGF誘導(dǎo)下細胞遷移的影響及WAVE-1對PKA-VASP信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。 方法：1.分別將重組質(zhì)粒pEGFP-C1/WAVE-1和對應(yīng)空質(zhì)粒pEGFP-C1通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至人ECV304細胞株,用G418篩選穩(wěn)定表達細胞株。通過熒光顯微鏡觀察融合蛋白的發(fā)光情況,并通過Western blot法檢測WAVE-1蛋白的表達變化。 2.將pEGFP-C1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株(對照組)和WAVE-1穩(wěn)定過表達細胞株(WAVE-1+組)分別用無血清(靜息狀態(tài)),20ng/ml PDGF 20h及預(yù)先加入St-Ht31作用1h再加PDGF處理,通過transwell小室跨膜遷移實驗檢測兩組細胞遷移情況；通過給予不同濃度纖連蛋白檢測兩組細胞的細胞黏附能力。同時檢測各處理因素下兩組細胞PKA活性和VASP磷酸化程度。通過免疫熒光觀察兩組細胞內(nèi)PKA的分布情況。 3.將VASP Ser157和Ser239磷酸化位點突變體分別瞬時轉(zhuǎn)染至對照組和WAVE-1+組,通過跨膜遷移實驗觀察PDGF誘導(dǎo)下細胞遷移的改變。 結(jié)果：1.熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),WAVE-1穩(wěn)定過表達細胞株中細胞發(fā)光率大于80%。Western blot顯示對照組在分子量110kD處無蛋白條帶出現(xiàn),而WAVE-1穩(wěn)定表達細胞株中WAVE-1蛋白在該處的表達量顯著增加。 2.靜息狀態(tài)下,對照組有少量細胞向跨膜小室下方遷移,而WAVE-1+組跨膜細胞與對照組相比顯著減少40%。PDGF刺激后,對照組跨膜細胞數(shù)量增加,而WAVE-1+組跨膜細胞數(shù)量較其無血清處理時進一步減少20%。St-Ht31干預(yù)后,對照組跨膜細胞減少；而此時WAVE-1+細胞數(shù)量較PDGF處理時顯著增加。結(jié)果提示W(wǎng)AVE-1+細胞的自發(fā)性遷移能力下降。PDGF抑制WAVE-1+細胞的趨化性遷移,阻斷WAVE-1與PKA結(jié)合可逆轉(zhuǎn)PDGF對WAVE-1+細胞遷移的抑制效應(yīng)。 3.對照組和WAVE-1+細胞對纖連蛋白各濃度時的細胞黏附情況皆無明顯差異性。 4.靜息狀態(tài)下,WAVE-1+組的PKA活性明顯高于對照組。PDGF刺激后,對照組和WAVE-1+組的PKA活性都明顯升高,但WAVE-1+組PKA活性顯著高于對照組。阻斷WAVE-1與PKA結(jié)合后兩組細胞的PKA活性均有所下降,但WAVE-1+PKA水平仍高于對照組。在各處理因素下WAVE-1+組細胞內(nèi)PKA水平皆對應(yīng)高于對照組,表明WAVE-1過度表達有利于促進PKA過度活化。 5.對照組及WAVE-1+組的VASP磷酸化表達的變化趨勢與PKA活性變化基本一致。在各處理因素下,WAVE-1+組VASP磷酸化水平皆對應(yīng)高于對照組,但增高幅度沒有PKA活性的變化幅度大。綜合PKA活性和VASP表達的結(jié)果,表明WAVE-1過度表達,可通過PKA途徑增強VASP磷酸化。 6.對照組細胞在靜息狀態(tài)時,PKA在細胞內(nèi)呈現(xiàn)廣泛性的分布,用PDGF刺激后,細胞漿和細胞邊緣出現(xiàn)散在點狀分布,細胞核仍有表達。而在靜息狀態(tài)時,WAVE-1過度表達的細胞內(nèi)PKA普遍聚集在核膜周圍,呈現(xiàn)明顯的“指環(huán)狀”分布。用PDGF刺激后,PKA從核膜上轉(zhuǎn)移分布到胞漿中,呈現(xiàn)彌散的點狀分布,細胞核內(nèi)基本無PKA表達。 7.VASP Ser157和Ser239位點突變體分別轉(zhuǎn)染到對照組細胞株和WAVE-1+細胞株后,這兩組細胞的跨膜遷移數(shù)量都明顯減少。在對照組細胞中,這兩個突變體對細胞遷移的抑制程度相當。在WAVE-1+細胞中,以VASP Ser157突變體的抑制程度為主,而VASP-S239A組對WAVE-1+細胞遷移的抑制程度無統(tǒng)計學(xué)差異。 結(jié)論：1.本研究成功建立人WAVE-1基因穩(wěn)定過表達細胞株。 2.過度表達WAVE-1可抑制細胞自發(fā)性遷移,抑制PDGF誘導(dǎo)的細胞遷移。這些與PKA的過度活化有關(guān)。 3.WAVE-1過度表達,增強了PKA活性和VASP磷酸化,這種效應(yīng)依賴于WAVE-1對PKA的錨定結(jié)合。 4.WAVE-1過度表達改變了PKA的亞細胞定位。 5.在WAVE-1過表達細胞內(nèi),VASP主要通過Ser157位點磷酸化維持著細胞應(yīng)對刺激的遷移能力。 第四部分2型糖尿病大鼠主動脈平滑肌細胞遷移和PKA及VASP的變化 目的：本研究建立2型糖尿病大鼠的在體動物模型,觀察主動脈粥樣硬化(AS)病變中血管平滑肌細胞(VSMC)遷移,探討VSMC遷移與PKA表達及VASP磷酸化之間的關(guān)系,為離體細胞研究尋求在體實驗依據(jù)。 方法：1.將8周齡雄性SPF級SD大鼠隨機分為2組：正常對照組(n=10),飼以正常飼料：2型糖尿病模型組(n=12),通過高脂飲食加小劑量鏈脲佐菌素(25mg/kg,腹注)復(fù)制2型糖尿病大鼠模型,共同飼養(yǎng)8周,檢測動物血糖、血脂、血膽固醇、糖基化血紅蛋白、血清胰島素等生化指標。2.取大鼠主動脈弓進行實驗,通過HE染色、透射電鏡觀察血管病變和VSMC的遷移情況；通過免疫組織化學(xué)法檢測VSMC、PKA和磷酸化的VASP在病變區(qū)域的表達和分布。 結(jié)果：1.各項血液指標的結(jié)果顯示DM組大鼠出現(xiàn)明顯高血糖、高糖基血紅蛋白、高膽固醇和胰島素抵抗的特征。 2.正常大鼠主動脈各層結(jié)構(gòu)正常,中膜VSMC排列整齊、與彈力纖維近似平行相間排列。DM組主動脈橫斷面上可見中膜增厚病灶,向血管腔內(nèi)突起。其中彈力纖維層次增多,增厚紊亂,大量膠原增生,并且網(wǎng)羅大量VSMC。VSMC顯著增生、泡沫化,排列紊亂。VSMC向內(nèi)膜方向聚集,部分VSMC穿過內(nèi)彈力板向內(nèi)膜下遷移。內(nèi)彈力板厚薄不均,有斷裂分離現(xiàn)象。 3.正常大鼠主動脈壁中PKA表達極少,散在分布在中膜VSMC內(nèi),著色部位主要在細胞漿,呈弱陽性表達。而2型糖尿病大鼠模型組PKA在中膜VSMC內(nèi)表達呈強陽性；并且PKA陽性表達的細胞增多,廣泛分布于血管中膜的淺層,在向內(nèi)膜遷移的VSMC分布區(qū)域也有大量聚集。 4.正常大鼠主動脈壁中磷酸化的VASP散在表達在中膜外層VSMC內(nèi),著色部位主要在細胞漿,呈弱陽性表達。而2型糖尿病大鼠模型組中磷酸化VASP在VSMC內(nèi)表達呈強陽性。VASP陽性表達的細胞聚集在向內(nèi)膜遷移的VSMC分布區(qū)域,內(nèi)膜下也有明顯表達。 結(jié)論： 1.2型糖尿病大鼠動脈粥樣硬化病灶部位存在VSMC的遷移。 2.2型糖尿病大鼠主動脈內(nèi)細胞遷移部位存在PKA和VASP磷酸化表達增強。
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【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R363.1

【參考文獻】

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1 黃華;王貴學(xué);;血管內(nèi)皮細胞遷移及相關(guān)影響因素研究進展[J];國際生物醫(yī)學(xué)工程雜志;2006年06期

2 周方正;伍鋼;;細胞偽足與腫瘤轉(zhuǎn)移研究進展[J];臨床腫瘤學(xué)雜志;2007年01期

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本文編號：1951804