本文選題：LIGHT + (lymphotoxin-like��； 參考：《第二軍醫(yī)大學》2008年博士論文

【摘要】： 腫瘤壞死因子超家族(TNFSF)成員具有促進細胞生長、分化或死亡的功能,在淋巴器官的形成,免疫細胞的激活及維持機體的穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要的生物學作用。近年來,發(fā)現(xiàn)了很多具有重要功能的TNF超家族成員,LIGHT(lymphotoxin-like,exhibits inducible expression,and competes with HSVglycoprotein D(gD)for HVEM,a receptor expressed by T lymphocytes),又名TNFSF14(tumor necrosis factor superfamily 14),或HVEM-L(Herpesvirus entrymediator Ligand)是Mauri等于1998年在對單純皰疹病毒活化T細胞的研究中發(fā)現(xiàn)的,是TNF超家族的第14個成員。LIGHT以三聚體的形式誘導表達于活化的T細胞、NK細胞,選擇性地表達于未成熟的樹突狀細胞(DCs)上。LIGHT有三個受體:單純皰疹病毒侵入介質(HVEM)、淋巴毒素β受體(LTβR)和可溶性誘餌受體3(DcR3,又稱TR6),均屬于TNF受體(TNFR)超家族成員。通過與不同的受體結合,LIGHT發(fā)揮著不同的生物學效應。體外研究表明,HVEM主要表達在靜止的T淋巴細胞、B淋巴細胞、單核細胞、NK細胞及未成熟DCs上,LIGHT/HVEM相互作用可以為T細胞的活化提供非CD28依賴性的共刺激信號,調節(jié)T細胞的免疫應答,參與激活特異性CTL反應,并誘導以IFN-γ和GM-CSF為代表的Th1型細胞因子分泌,誘導未成熟DCs成熟。LTβR主要表達于基質細胞,不表達于淋巴細胞和DCs,LIGHT/LTβR信號通路可誘導腫瘤細胞的凋亡,產(chǎn)生各種細胞因子并在器官形成過程中,如腸系膜淋巴結的形成以及次級淋巴樣結構和功能重建過程中,起著重要作用。DcR3則主要由腫瘤細胞及活化的T淋巴細胞表達,作為可溶性的誘餌受體,DcR3通過競爭LIGHT配體,干擾或阻斷LIGHT/HVEM及LIGHT/LTβR信號通路,從而對免疫應答和免疫自穩(wěn)進行調節(jié),參與腫瘤細胞的免疫逃逸。 近年來針對LIGHT生物學功能的研究多集中于它在機體的自身免疫、腫瘤免疫以及器官移植的排斥反應中的作用。LIGHT的過度表達(LIGHT~(+/+))往往導致T淋巴細胞的過度活化,從而導致機體自身免疫功能的紊亂,出現(xiàn)自身免疫性疾病;而LIGHT缺失或敲除(LIGHT~(-/-))可使CD8~+T細胞的分化增殖能力降低,CTL強度減弱,分泌TNF-α的能力降低。對于DCs的影響,近期有學者發(fā)現(xiàn),可溶性LIGHT可以誘導骨髓增生異常綜合癥(MDS)病人來源的未成熟DCs成熟,促進其表面成熟標志的表達,增強其抗原遞呈能力,還促進T細胞分泌Th1型細胞因子。LTβR-Ig或HVEM-Ig作為LIGHT/HVME通路的阻斷劑,可以有效抑制該通路的激活,降低了T淋巴細胞的活化程度,因而被廣泛應用于自身免疫病及器官移植排斥反應的防治研究中。同時,另有文獻報道,LTβR-Ig通過阻斷LT/LTBR通路,促進了DSS誘導的腸炎發(fā)生,加重疾病程度�？梢�,LTβR-Ig的應用可以產(chǎn)生多種效應,關鍵看在不同疾病模型中,哪條信號通路起主要作用。 那么LTβR-Ig的作用機理,除了被動的阻斷刺激通路之外,是否也可以通過與細胞表面受體的結合,造成新的信號通路的激活,引起受體所在細胞狀態(tài)及功能的改變,進而影響體內免疫反應,目前國內外尚無相關報道。LTβR-Ig可以與兩個膜表達型分子結合:LTa_1β_2和LIGHT。LTa_1β_2主要表達與活化的T淋巴細胞表面,通過與間質細胞表面的LTβR結合,參與次級淋巴器官和脾臟的發(fā)育,特別對生發(fā)中心的形成以及(濾泡樹突狀細胞)FDC網(wǎng)絡的維持起重要作用。LIGHT除了表達于活化的T淋巴細胞、NK細胞之外,還表達于未成熟的樹突狀細胞。由此可以看出,如果將LTβR-Ig作用于活化的T細胞,則可以同時結合LTa_1β_2和LIGHT;而如果作用于未成熟DCs,則LTβR-Ig只可與未成熟DCs表面的LIGHT結合。 關于未成熟DCs表面表達的LIGHT是否可以直接向未成熟DCs傳遞信號,影響未成熟DCs功能,目前國內外也未見報道。然而用可溶性受體蛋白作用于DCs,模擬T細胞與DCs之間的信號通路,研究相應共刺激通路的反向信號的文章,已見報道。例如,用可溶性CTLA-4-Ig模擬T細胞表面的CTLA-4,作用于DCs表達的B7-1/B7-2,發(fā)現(xiàn)CTLA-4-Ig可以刺激DCs產(chǎn)生IFN-γ;后者通過誘導吲哚胺2、3過氧化酶(IDO)活性增強,大量分解T細胞增殖分化所必須的氨基酸——色氨酸,從而抑制活化T細胞的增殖;該效應在維持母體和胎兒之間的免疫耐受、抑制T細胞對腫瘤、自身抗原及MHC不相容移植物的反應具有重要作用。此外,表達在B細胞上的B7-2也可傳遞逆向信號給B細胞,刺激B細胞產(chǎn)生IgGl和IgE;這種作用對于B7-2高表達的記憶B細胞特別重要。說明,B7分子不僅可通過CD28/CTLA-4正向傳遞共刺激信號或共抑制信號給T淋巴細胞,還可以逆向傳遞信號給抗原遞呈細胞或B淋巴細胞,調節(jié)它們的免疫功能,以達到調控機體免疫應答的目的。另外,可溶性CD28(CD28-Ig)可以通過B7-1、B7-2促進DCs分泌IL-6和IFN-γ;CD28-Ig處理過的DCs可以增強機體T細胞介導的抗腫瘤、抗微生物免疫應答以及MHC-Ⅰ類抗原限制性遲發(fā)型變態(tài)反應。由此可見,B7-CTLA-4和B7-CD28均可以互為配受體,具有雙向傳遞信號的能力;也反映出共刺激分子對機體免疫功能的調節(jié)是復雜的、多樣性的。 除了B7家族成員可以傳遞反向信號之外,TNF家族成員也有相似功能。最近報道的TNFR超家族成員GITR與其配體GITRL便可互為配受體,可以雙向傳遞信號,調控免疫反應。LIGHT作為TNF家族的新成員,可以作為共刺激分子,為T細胞的活化提供刺激信號,同時還可以誘導骨髓增生異常綜合征(MDS)病人來源的未成熟DCs的成熟。這些已有的相關研究都主要集中在LIGHT與不同的受體結合之后,發(fā)揮的不同生物學功能,那么LIGHT自身是否也可以向其表達細胞傳遞信號,它與其受體之間是否也互為配受體,目前尚未見報道。 本課題就上述問題展開研究,用LTβR-Ig融合蛋白作為工具,初步探討LIGHT是否可以傳遞信號作用于未成熟DCs,對未成熟DCs的表型及功能產(chǎn)生影響,進而起到免疫調節(jié)作用。所得研究結果,將進一步豐富LIGHT-共刺激通路的理論知識。 第一部分驗證LTβR-Ig融合蛋白可與未成熟DCs表面LIGHT有效結合 LTβR-Ig與未成熟DCs的有效結合是本課題的研究基礎,因此必須對LTβR-Ig的生物學活性及其結合效力進行驗證。 (1)首先檢測LTβR-Ig的生物學活性 【方法】將C57BL/6小鼠的脾臟單個核細胞作為反應細胞,BALB/C小鼠的脾臟單個核細胞經(jīng)過絲裂霉素處理后,作為刺激細胞,兩種細胞1:1混合培養(yǎng),并加入LTβR-Ig或者對照人IgG,或與融合蛋白相同體積的PBS。3天后檢測~3[H]-TdR摻入量。 【結果】LTβR-Ig組的T細胞增殖明顯被抑制。 【結論】單向混合淋巴細胞反應證實了LTβR-Ig可以有效阻斷LIGHT-HVEM信號通路,對同種異基因混合淋巴細胞的增殖有明顯的抑制作用。 (2)檢測LTβR-Ig與未成熟DCs的特異性結合 【方法】先用間接標記的方法,即先用大鼠抗小鼠LIGHT抗體與不同成熟狀態(tài)的DCs結合,然后加入熒光標記的抗大鼠的二抗,流式細胞儀檢測不同成熟狀態(tài)的DCs表面LIGHT的表達水平。同樣是間接標記法,再檢測LTβR-Ig與未成熟DCs的結合效力,設抗LIGHT抗體阻斷對照及IgG對照。 【結果】在未成熟DCs表面,LIGHT有較高水平的表達;在LPS誘導成熟的DCs表面,LIGHT的表達水平明顯下降,與文獻報道相符。LTβR-Ig可以有效結合于未成熟DCs,而對照IgG則不能,且這種結合可以被抗LIGHT抗體阻斷。 【結論】LTβR-Ig可以特異性識別未成熟DCs表達的LIGHT。 第二部分LTβR-Ig融合蛋白對小鼠未成熟DCs表型、抗原吞噬及遞呈功能的影響 本部分實驗以LTβR-Ig體外模擬LTβR與未成熟DCs表面LIGHT的結合,觀察LIGHT被激活后,是否可以直接向未成熟DCs傳遞信號,對未成熟DCs的免疫表型、抗原吞噬能力和抗原遞能力造成影響。【方法】我們用GM-CSF、IL-4體外擴增C57BL/6小鼠骨髓來源的DCs,于擴增的第5天收集細胞,并用CD11c磁珠純化,得到高純度的未成熟DCs。然后體外繼續(xù)培養(yǎng),并在培養(yǎng)體系中加入LTβR-Ig(終濃度為50μg/ml)或相同終濃度的IgG或與融合蛋白等體積的PBS:①于加入蛋白后24h、48h分別檢測DCs的免疫表型;②加入蛋白后24h收集各組DCs,用FITC標記的卵白蛋白(FITC-OVA)作為抗原,檢測各組DCs對該抗原的吞噬能力,流式細胞儀檢測PE-CD11c~+DCs中,FITC-OVA~+細胞的百分率及平均熒光強度,用以反映DCs的吞噬能力③收集不同蛋白作用24h后各組DCs,與CFSE預染的OVA_(323-339)肽特異性CD4~+T細胞混合培養(yǎng)84h,流式細胞儀檢測CD4~+T細胞CFSE的熒光強度,用以反應不同處理組DCs的抗原遞呈能力�！窘Y果】①LTβR-Ig作用后的DCs,CD40、CD86、CD83的表達水平高于對照組(IgG及空白對照),IA~b的表達水平各組沒有顯著差異;②LTβR-Ig處理的DCs攝取和吞噬FITC-OVA的能力弱于IgG對照組,IgG組和PBS對照組之間沒有顯著差異;③與LTβR-Ig作用過的DCs混合培養(yǎng)的抗原特異性CD4~+T細胞表面活化標志CD25、CD69表達上調,CFSE熒光強度明顯低于IgG對照組,說明LTβR-Ig作用過的DCs抗原遞呈能力增強�！窘Y論】從DCs的免疫表型、抗原吞噬及抗原遞呈功能等方面,初步說明LTβR-LIGHT信號通路可以反向傳遞刺激信號給未成熟DCs,誘導DCs的成熟。 第三部分LTβR-Ig對DCs分泌細胞因子及抗原特異性CD4~+T細胞生物學功能的影響 進一步深入探討LTβR-Ig誘導DCs成熟的機制�！痉椒ā坑肊LISA和Realtime-PCR的方法,分別從蛋白質水平和mRNA水平檢測DCs分泌IL-12、IL-10、IL-6、TNF-α等細胞因子及趨化因子的水平。檢測了DCs與OVA_(323-339)肽特異性T細胞混合培養(yǎng)后,T細胞的胞內及上清中IL-2、IL-4、IFN-γ的表達水平�！窘Y果】①EMSA結果顯示:IL-6明顯升高(p＜0.5),且IL-6的表達水平與加入LTβR-Ig的量呈明顯的劑量依賴關系,即伴隨LTβR-Ig加入濃度的逐漸升高,IL-6的分泌量也逐漸增高。其他細胞因子的表達水平與對照組均無差異,IL-1β的表達水平低于ELISA檢測試劑盒的下限。②Real time-PCR結果顯示:在LTβR-Ig作用后3h,IL-6和IL-1β的表達水平顯著升高(p＜0.01;),IL-10、CCR7及CCL19的表達沒有變化;TGFβ和ICOSL的表達略有下降但無統(tǒng)計學差異。③LTβR-Ig作用后的DCs促進抗原特異性T細胞分泌IL-4,抑制IFN-γ。若在DCs的培養(yǎng)過程中加入抗IL-6的阻斷抗體,則IL-4升高、IFN-γ降低的現(xiàn)象消失。【結論】IL-6在DCs的成熟過程中發(fā)揮著重要作用。LTβR-Ig促進DCs成熟,促進抗原特異性CD4~+T細胞分泌Th2型細胞因子均是通過促DCs高分泌IL-6實現(xiàn)的。 為了排除實驗過程中可能存在的LPS污染,我們使用的所有金屬器具均經(jīng)過250℃高溫烘烤30min以上,滅活LPS。所有塑料器具均是一次性無熱源產(chǎn)品。此外,還實驗證實了無LPS污染。【方法】將LTβR-Ig煮沸10min,使之完全變性之后再作用于未成熟DCs,觀察未成熟DCs分泌IL-6的水平。【結果】煮沸后LTβR-Ig不能促進DCs高分泌IL-6,與對照組無差異。【結論】DCs分泌IL-6增高不是LPS污染導致的,而是LTβR-Ig與LIGHT特異性結合所引起的。 第四部分LTβR/LIGHT信號通路對DCs及T細胞功能影響的體內實驗研究 本部分主要是對體外實驗的體內驗證�！痉椒ā竣倏乖禺愋訲淋巴細胞反應:將LTβR-Ig處理24h的C57BL/6小鼠骨髓來源的DCs,與CFSE預染的OVA_(323-339)肽特異性CD4~+T細胞按1:10的比例混合(DCs:5×10~5/只;T:5×10~6/只),經(jīng)尾靜脈回輸入小鼠體內,同時尾靜脈注射入200nmol的OVA_(323-339)肽,在無病原菌的環(huán)境下飼養(yǎng)3天后處死動物。取脾和淋巴結的淋巴細胞,用PE-CD4流式抗體標記細胞,流式細胞儀檢測脾及淋巴結中CFSE陽性細胞的增殖情況,ELISA檢測血清中細胞因子的表達水平。②同種異體混合淋巴細胞反應:先將BALB/C小鼠的脾臟單個核細胞用CD4和CD8磁珠進行陽性篩選,得到富集的T細胞,并用CFSE染色。然后LTβR-Ig處理C57BL/6來源第5天DCs24之后,與CFSE預染的BALB/C小鼠來源的脾臟及淋巴結T細胞胞以1:10比例混合(DCs:5×10~5/只;T:5×10~6/只)后,經(jīng)尾靜脈注射入8Gry ~(60)Go照射后的正常BALB/C小鼠體內,3天后處死動物,取脾和淋巴結的淋巴細胞,用PE-CD4流式抗體標記細胞,流式細胞儀檢測脾及淋巴結中CFSE陽性細胞的增殖情況,ELISA檢測血清中細胞因子的表達水平�！窘Y果】與體外實驗一致,LTβR-Ig處理過的DCs回輸入體內后,對抗原特異性T淋巴細胞反應以及同種異基因混合淋巴細胞的增殖,均起到刺激作用。并且促進T細胞分泌IL-4,部分增強Th2型免疫反應。 在本研究中,我們首次用LTβR-Ig融合蛋白為工具,研究LIGHT-信號通路是否存在反向信號。首先,用流式細胞術的方法證實LTβR-Ig可以與DCs表面的LIGHT分子有效結合,在此基礎上研究LTβR-Ig通過LIGHT對DCs狀態(tài)及功能的影響。從DCs細胞的免疫表型、細胞因子的分泌、吞噬能力和抗原遞呈能力等各方面的實驗結果均顯示LTβR-Ig促進DCs的成熟,增強DCs對抗原特異性T淋巴細胞的刺激能力,提示LTβR-LIGHT對DCs的免疫功能存在反向調節(jié)作用。最后,通過尾靜脈回輸LTβR-Ig作用過的DCs,體內證實LTβR-Ig作用后的DCs可以促進抗原特異性CD4~+T細胞反應。至于LIGHT其他兩個受體是否也可以通過LIGHT向DCs傳遞類似的刺激信號,這需要進一步探討。本研究所得結論將進一步豐富LIGHT-信號通路對免疫反應調控的理論知識。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R392

【共引文獻】

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本文編號：1944962