本文選題：蟲媒病毒 + 病毒分離鑒定��； 參考：《中國疾病預(yù)防控制中心》2010年博士論文

【摘要】： 本研究在我國云南省(中緬佬)邊境地區(qū)開展連續(xù)兩年的蟲媒病毒調(diào)查,在采集到的蚊蟲標本中分離到多株蟲媒病毒,并利用血清學,分子生物學及生物信息學等理論與方法對本次調(diào)查中分離的病毒和在云南省分離的其他蟲媒病毒進行了鑒定及分子特征研究,結(jié)果報告如下。 1云南省(中緬佬)邊境地區(qū)蚊蟲種類及蚊傳病毒調(diào)查 本研究于2005年和2006年連續(xù)兩年的夏季在中緬佬邊境地區(qū)三個自然村開展蚊蟲媒介及蟲媒病毒調(diào)查。在該地區(qū)共采集到4屬(庫蚊屬、Lufzia蚊屬、按蚊屬和阿蚊屬)17種蚊蟲。各采集點優(yōu)勢蚊種分析顯示,三帶喙庫蚊是曼夕村(62.71%／1838／2931)和曼恩村(90.98%／5924／6511)的優(yōu)勢蚊種,中華按蚊是曼國村(67.11%／3544／5281)的優(yōu)勢蚊種。對采集到的14723只蚊蟲標本分為152批常規(guī)處理,接種組織培養(yǎng)細胞(C6／36和BHK-21細胞)分離病毒。在當?shù)夭杉娜龓о箮煳脴吮局泄卜蛛x到14株病毒(其他蚊蟲未分離到病毒),分別隸屬于4病毒科5病毒屬6種病毒。病毒包括,披膜病毒科(Togaviridae)甲病毒屬(Alphavirus)辛德畢斯病毒(Sindbis virus)(1株),黃病毒科(flaviviridae)黃病毒屬(Flavivirus)乙腦病毒(Japanese Encephalitis virus)(2株),呼腸孤病毒科(Reoviridae)東南亞12節(jié)段雙鏈RNA病毒屬(Seadornavirus)新東南亞12節(jié)段雙鏈RNA病毒(Novel Seadornavirus)(1株)、呼腸孤病毒科(Reoviridae)環(huán)狀病毒屬(Orbivirus)云南環(huán)狀病毒(Yunnan orbivirus)(6株)和新環(huán)狀病毒(Novel orbivirus)(1株)及細小病毒科(Parvoviridae)濃核病毒屬(Densovirus)病毒淡色庫蚊濃核病毒(Culex pipiens pallens Densovirus)(3株)。在當?shù)夭杉牟幻髟虬l(fā)熱和病毒性腦炎患者急性期血清標本中檢測到乙腦病毒,辛德畢斯病毒,云南環(huán)狀病毒,新環(huán)狀病毒和新東南亞12節(jié)段雙鏈RNA病毒IgM抗體,抗體總陽性率為36.1%(178／493),提示當?shù)卮嬖谝陨喜《镜募毙云诟腥�。其中辛德畢斯病�?云南環(huán)狀病毒,新環(huán)狀病毒和新東南亞12節(jié)段雙鏈RNA病毒IgM抗體陽性均是在當?shù)厥状螆蟮�。提示在云南�?中緬佬)邊境地區(qū)地區(qū)存在多種蟲媒病毒,并可能是當?shù)貍魅静≈虏〔≡w或潛在病原體。 2.云南省新分離病毒分子生物學鑒定及分子特征研究 利用分子生物學方法對20世紀80年代以來從云南省多種蚊蟲、蝙蝠和病人標本中分離到的26株病毒分離物進行分子生物學鑒定。結(jié)果顯示19株分離物為乙腦病毒,其中17株屬基因Ⅲ型乙腦病毒,2株屬基因Ⅰ型乙腦病毒；3株分離物為4型登革病毒,進一步分析表明這3株病毒均為基因Ⅰ型登革病毒；1株分離物為科薩努爾森林病病毒；其余3株病毒為泰勒病毒。 3.我國蝙蝠分離乙腦病毒全基因組分子特征研究 對分離自云南省蝙蝠的兩株乙腦病毒進行了全基因組序列測定與分析,結(jié)果顯示兩株病毒全基因組全長均為10977nt,編碼3432氨基酸。兩株病毒之間核苷酸和氨基酸序列同源性均高于99.9%。與國際基因庫(GenBank)55株乙腦病毒全基因序列進行比較發(fā)現(xiàn)蝙蝠分離株與其他宿主來源分離株核苷酸序列同源性在88.6%(KV1899) -99.3%(Nakayama)之間,氨基酸同源性在97%(K94P05)-99.7%(JaGAr01)之間。分析還顯示蝙蝠分離株與云南當?shù)匾夷X病例標本分離株Liyujie (1979)和蚊蟲分離株BN19株(1982)處在同一進化簇,提示蝙蝠分離的乙腦病毒可能是當?shù)匾夷X病毒的保存宿主并參與當?shù)亓餍行砸倚湍X炎的流行有關(guān)。這是國際上首次進行的蝙蝠分離乙腦病毒全基因組序列分析。 4.云南省辛德畢斯病毒(MX10)株全基因組分子特征研究 MX10病毒是在云南省中緬佬邊境地區(qū)開展蟲媒病毒調(diào)查時分離的病毒,經(jīng)鑒定為辛德畢斯病毒。此后在實驗室經(jīng)病毒噬斑純化得到噬斑形態(tài)具有明顯區(qū)別的兩個病毒株,分別命名為MX10-LP和MX10-SP。兩病毒株在生物學及分子生學存在較大差異。MX10-SP病毒對BHK-21細胞感染能力比MX10-LP病毒低4倍；MX10-SP病毒在C6／36細胞上出現(xiàn)CPE時間比MX10-LP快48h。兩株病毒接種1日齡乳鼠后,MX10-LP和MX10-SP病毒致死時間分別為4d和6d。病毒全基因組序列分析顯示兩株病毒全基因組(不包括5‘帽子結(jié)構(gòu)和3’多聚A)均為11700nt,核苷酸同源性為99.9%。大小斑病毒基因組間存在7個核苷酸差異(5個氨基酸差異)。MX10-LP和MX10-SP與馬來西亞原型株MRE16病毒全基因核苷酸同源性僅為91.3%,氨基酸同源性為98.1%。NS3基因分析結(jié)果顯示,與Paleoarctic/Ethiopian和western/Australian genotype辛德畢斯病毒相比,Oriental/Australian genotype辛德畢斯病毒MRE16株在NS3基因插入了57個核苷酸,而MX10-LP和MX10-SP病毒則63個核苷酸。以上研究結(jié)果提示中國分離的辛德畢斯病毒(MX10)為澳大利亞東方型辛德畢斯病毒(Oriental/Australian genotype)與該基因型原型株(MRE16)相比在病毒生物學表型和分子生物特征均存在較大差異,表明Oriental/Australian genotype基因型辛德畢斯病毒可能存在多種分子差異的變異株。這是在我國首次發(fā)現(xiàn)的該基因型辛德畢斯病毒。 5.云南省蝙蝠分離病毒的鑒定及其與疾病關(guān)系的研究 對三株分離自蝙蝠腦組織的病毒分離物(B90-121-125、B90-126-130和B8613)采用非序列依賴擴增(SISPA)和RT-PCR的方法進行分子生物學研究。初步鑒定結(jié)果顯示三株分離自蝙蝠的病毒與泰勒病毒DA株核苷酸同源性最高為94.7%,提示為泰勒病毒。B90-126-130病毒株全基因組須列分析,結(jié)果顯示B90-126-130病毒基因組長8094 nt,編碼2301 aa。與GenBank中46株腦心肌炎屬病毒比較,B90-126-130病毒與泰勒病毒DA分離株全基因組序列同源性最高,核苷酸同源性均為90.3%,氨基酸同源性為96.4%,與其他8株泰勒病毒核苷酸同源性在86.9%-88%之間,氨基酸同源性在94.3%-96.3%之間。病毒腦內(nèi)接種1日齡乳鼠,5天乳鼠發(fā)病死亡,B90-126-130病毒對乳鼠LD50為7.38。B90-126-130病毒不引起B(yǎng)HK-21、C6/36、Vero、MDCK和Tubli細等胞產(chǎn)生細胞病變,但在Tubli細胞第3代培養(yǎng)上清中病毒核酸檢測陽性,其余4種細胞核酸檢測陰性。此外,使用重組原核表達B90-126-130病毒VP1、3D和3ABC三個基因蛋白,建立ELISA檢測方法檢測病人和蝙蝠血清中病毒抗體。結(jié)果顯示在云南省西雙版納和德宏州地區(qū)采集的461份發(fā)熱腦炎病人血清中,17.14%標本(79／461)為B90-126-130病毒IgM抗體陽性,43.82%(202／461)標本為IgG抗體陽性。同時在云南省德宏州采集的32份蝙蝠血清中有7份標本B90-126-130抗體檢測陽性。本研究結(jié)果明確了在云南省蝙蝠中分離的三株病毒均為泰勒病毒,該病毒僅能在蝙蝠來源的Tubli細胞復(fù)制和對乳鼠具有較強的神經(jīng)毒力。此外還提示當?shù)厝巳汉万鹬写嬖谔├詹《靖腥?該病毒可能是引起當?shù)夭幻髟虬l(fā)熱和腦炎的病原體或潛在的病原體。 本研究創(chuàng)新點及意義 本研究首次在云南省邊境(中緬佬)地區(qū)進行蚊蟲媒介、蟲媒病毒分布以及人群感染情況的綜合性調(diào)查,在當?shù)胤蛛x到大量蟲媒病毒(其中多株為我國首次分離)并證明當?shù)卮嬖诓《靖腥?研究結(jié)果對于解釋當?shù)匕l(fā)熱甚至病毒性腦炎的病因提供了重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù),具有重要的公共衛(wèi)生意義。對當?shù)囟嗄陙矸蛛x自多種蚊蟲、蝙蝠和病人標本的26余株病毒分離物進行了分子生物學研究,明確了這些病毒在病毒學的分類地位及其與疾病的關(guān)系。以上結(jié)果極大地豐富了我國蟲媒病毒的背景信息,為云南省及我國蟲媒病毒病預(yù)防和控制以至于對蟲媒病毒病的國際聯(lián)防等均具有重要意義。
[Abstract]:This study was carried out in Yunnan Province ( China - Burma ) border area for two consecutive years of insect vector virus investigation . The virus isolated from this investigation and other arboviruses isolated in Yunnan province were identified by serological , molecular biology , bioinformatics and other theories and methods . The results were as follows .



Investigation on mosquito species and mosquito - borne viruses in the border areas of Yunnan Province



A total of 14723 species of mosquitoes were isolated from three natural villages in China and Myanmar in the summer of two years in 2005 and 2006 .



2 . Molecular Biological Identification and Molecular Characterization of New Isolated Virus in Yunnan Province



The molecular biology of 26 strains isolated from several species of mosquitoes , bats and patients in Yunnan province has been identified by molecular biology method . The results showed that 19 isolates were encephalitis virus , 17 belonged to type 鈪，

本文編號：1938337