本文選題：TF + 凝血因子Ⅲ��； 參考：《山西大學(xué)》2010年碩士論文

【摘要】： 組織因子(tissue factor, TF)是相對(duì)分子量為47 kD的跨膜糖蛋白,在調(diào)節(jié)凝血功能方面有重要的作用,近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)TF參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展、血管生成和腫瘤生長(zhǎng)等非凝血功能。利用TF單克隆抗體的導(dǎo)向性和特異性,抑制TF的活性,從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。由于鼠源性抗體藥物對(duì)人類具有免疫原性,其廣泛的臨床應(yīng)用受到極大限制,而采用基因工程技術(shù)對(duì)鼠源性抗體進(jìn)行人源化改造是治療用抗體的重要手段。因此,本文在自行研制的抗人TF鼠源性單克隆抗體的基礎(chǔ)上,利用基因工程抗體技術(shù),成功構(gòu)建了抗人TF人-鼠嵌合抗體基因的真核共表達(dá)質(zhì)粒。將其轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞,篩選獲得能分泌表達(dá)TF嵌合抗體的CHO穩(wěn)定細(xì)胞株(JJ3),經(jīng)Protein A親和層析柱純化獲得高純度的抗TF嵌合抗體,體外分析該抗體具有抗凝血活性和對(duì)K562和HL-60癌細(xì)胞生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用,為TF抗體治療的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 首先利用RNA提取試劑盒,從分泌TF鼠源性抗體的雜交瘤細(xì)胞(mTA)中提取總RNA,以鼠源性TF單克隆抗體重鏈可變區(qū)(VH)及輕鏈可變區(qū)(VL)基因序列設(shè)計(jì)特異性引物,采用RT-PCR獲得重鏈和輕鏈可變區(qū)目的基因。將目的基因分別與pCN40表達(dá)載體連接,構(gòu)建成重組質(zhì)粒pCN40-VL-VH。經(jīng)AgeⅠ、BstBⅠ和HpaⅠ、EcoRⅠ分別對(duì)重組質(zhì)粒酶切鑒定和瓊脂糖凝膠電泳分析,兩條目的基因片段大小約為300 bp,與理論值(321 bp、351 bp)相吻合,測(cè)序分析其序列與目的基因序列一致,表明已成功構(gòu)建了抗人TF人-鼠嵌合抗體重組質(zhì)粒pCN40-VL-VH。 其次,以中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO-K1)為宿主細(xì)胞,采用中量無(wú)內(nèi)毒素提取質(zhì)粒試劑盒提取重組質(zhì)粒pCN40-VL-VH,陽(yáng)離子脂質(zhì)體方法轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞,經(jīng)G418硫酸鹽(800μg/mL)篩選,并通過(guò)有限稀釋法克隆化培養(yǎng),培養(yǎng)上清經(jīng)間接ELISA檢測(cè)。對(duì)篩選的分泌抗體陽(yáng)性細(xì)胞株培養(yǎng)上清經(jīng)間接ELISA、Western blot方法分析,獲得了轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pCN40-VL-VH的CHO細(xì)胞株(JJ3),并能穩(wěn)定地分泌抗人TF人-鼠嵌合抗體。利用rProtein A親和層析柱純化該細(xì)胞培養(yǎng)上清中的抗體,純化后的產(chǎn)品經(jīng)紫外分光光度計(jì)定量分析抗體產(chǎn)量約為50 mg/L。經(jīng)SDS-PAGE分析：純化嵌合抗體的重鏈和輕鏈的分子量分別約為50 kD和26 kD,純度達(dá)到97%以上。 最后,選擇K562、HL-60、LOVO、BEL-7402人腫瘤細(xì)胞株,采用MTT法,體外研究了該純化抗體對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果表明：在一定濃度范圍內(nèi),該抗體能夠明顯地抑制K562和HL-60細(xì)胞的生長(zhǎng),最大抑制率分別為35%和64.9%,且呈劑量效應(yīng)關(guān)系,而對(duì)LOVO和BEL-7402細(xì)胞生長(zhǎng)沒(méi)有明顯的影響。不同濃度的嵌合抗體與27.4μg/mL的TF溫育1.5 h,經(jīng)脂化和凝血酶原時(shí)間測(cè)定,表明隨著嵌合抗體濃度的升高,與對(duì)照組相比,正常人血漿的PT顯著延長(zhǎng)(P0.01)。 上述結(jié)果表明：本研究構(gòu)建了抗人TF人-鼠嵌合抗體重組質(zhì)粒pCN40-VL-VH,轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞并獲得能夠穩(wěn)定表達(dá)抗人TF人-鼠嵌合抗體的CHO-K1細(xì)胞株(JJ3),經(jīng)親和層析獲得純度達(dá)97%以上的抗人TF人-鼠嵌合抗體,體外實(shí)驗(yàn)表明該抗體具有抗凝活性和有效地抑制K562和HL-60細(xì)胞增殖的活性。
[Abstract]:Tissue factor ( TF ) is a transmembrane glycoprotein with a relative molecular weight of 47 kD . It plays an important role in regulating the coagulation function . In recent years , it has been found that TF is involved in the development of atherosclerosis , angiogenesis and tumor growth .


The recombinant plasmid pCN40 - VL - VH was amplified by RT - PCR . The recombinant plasmid pCN40 - VL - VH was amplified by RT - PCR . The recombinant plasmid pCN40 - VL - VH was constructed by RT - PCR . The recombinant plasmid pCN40 - VL - VH was constructed by sequencing and sequencing . The recombinant plasmid pCN40 - VL - VH was constructed successfully .


The recombinant plasmid pCN40 - VL - VH was extracted from Chinese hamster ovary cells ( CHO - K1 ) . The recombinant plasmid pCN40 - VL - VH was extracted with a medium dose of the plasmid pCN40 - VL - VH . The recombinant plasmid pCN40 - VL - VH was screened by indirect ELISA . The purified product was purified by indirect ELISA . The purified product was purified by indirect ELISA . The purified product was analyzed by SDS - PAGE . The molecular weight of the heavy chain and light chain of purified chimeric antibody was about 50 kD and 26 kD , respectively , and the purity was above 97 % .


Finally , the effects of the purified antibody on the proliferation of tumor cells were studied by MTT assay . The results showed that the growth of K562 and HL - 60 cells was significantly inhibited by MTT assay . The maximal inhibitory rates were 35 % and 64.9 % , respectively , and there was no significant effect on the growth of LOVO and BEL - 7402 cells .


The results showed that the recombinant plasmid pCN40 - VL - VH of anti - human TF human - mouse chimeric antibody was constructed and the CHO - K1 cell line ( JJ3 ) capable of stably expressing anti - human TF human - mouse chimeric antibody was constructed . The anti - human TF human - mouse chimeric antibody with purity of over 97 % was obtained by affinity chromatography . The in vitro experiment showed that the anti - human TF human - mouse chimeric antibody had anticoagulant activity and effectively inhibited the proliferation of K562 and HL - 60 cells .
【學(xué)位授予單位】：山西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：1937795