本文選題：基因敲除 + uhpT��； 參考：《沈陽藥科大學(xué)》2009年碩士論文

【摘要】： 本文以基因敲除方法研究志賀氏菌的功能基因,以RecA重組系統(tǒng)為基礎(chǔ),采用低拷貝自殺質(zhì)粒pCVD442作為本敲除體系的重組載體,為了克服該質(zhì)粒在進行分子克隆操作中的困難,將Gateway技術(shù)應(yīng)用在敲除前期的重組質(zhì)粒構(gòu)建過程中,成功構(gòu)建了福氏志賀菌2a型301株uhpT基因部分缺失的突變體MT,從而建立了在福氏志賀菌中進行定位插入或缺失突變的敲除技術(shù)平臺。 對突變株分別在培養(yǎng)基、細胞水平進行了功能檢測。在普通LB培養(yǎng)基及TSB培養(yǎng)基中突變株與野生株的生長沒有顯著差異；突變株在U937細胞的胞內(nèi)存活增殖能力與野生株沒有顯著差異,在HeLa細胞的胞內(nèi)存活增殖能力突變株比野生株下降了12.7%。這說明uhpT基因在志賀氏菌的胞內(nèi)存活增殖中仍然具有一定的作用。上述結(jié)果提示志賀氏菌中uhpT基因與細菌在細胞內(nèi)的存活和增殖有關(guān),可能由于細菌中其它碳源物質(zhì)轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)的存在代償了敲除基因的功能缺陷,因此突變體在生長水平?jīng)]有特別顯著的變化。 利用Gateway技術(shù)與自殺質(zhì)粒相結(jié)合的敲除體系具有高效高通量的特點。本研究建立了一種對福氏志賀菌功能基因組研究有效的基因敲除技術(shù)平臺,并且提供了對志賀氏菌中未知功能基因研究值得參考的新思路。
[Abstract]:In this paper, the functional gene of Shigella was studied by gene knockout method. Based on the RecA recombination system, the low copy suicide plasmid pCVD442 was used as the recombinant vector of the knockout system. The Gateway technique was applied to the construction of recombinant plasmid in the early stage of knockout. The mutant MTT with partial deletion of uhpT gene of Shigella flexneri strain 2a was successfully constructed, and a knockout technique platform for localizing insertion or deletion mutation in Shigella flexneri was established. The function of the mutant was detected in medium and cell level respectively. There was no significant difference between the growth of mutant and wild strain in common LB medium and TSB medium, but there was no significant difference in survival and proliferation ability between mutant and wild strain in U937 cells. The ability to survive and proliferate in HeLa cells decreased by 12. 7% as compared with wild strains. This suggests that uhpT gene still plays a role in the intracellular survival and proliferation of Shigella. These results suggest that the uhpT gene in Shigella is related to the survival and proliferation of bacteria in cells, which may be due to the functional deficiency of the knockout gene due to the existence of other carbon-source transferase systems in the bacteria. Therefore, there was no significant change in the growth level of the mutant. The knockout system using Gateway and suicide plasmids has the characteristics of high efficiency and high throughput. In this study, an effective gene knockout platform was established for the study of Shigella flexneri functional genomes, and a new idea for the study of unknown functional genes in Shigella flexneri was provided.
【學(xué)位授予單位】：沈陽藥科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R378

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本文編號：1934060