胸腺是T細(xì)胞分化、發(fā)育、成熟的主要器官。從骨髓遷入的淋巴樣祖細(xì)胞在與獨(dú)特的胸腺微環(huán)境基質(zhì)細(xì)胞的相互作用下,經(jīng)過復(fù)雜的分化發(fā)育過程,最終成為功能性CD4+T細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞。由于在體內(nèi)很難進(jìn)行單一細(xì)胞群體或某種特殊分子對(duì)胸腺發(fā)育影響的研究,使胸腺發(fā)育的研究一直難以取得突破性進(jìn)展,體外培養(yǎng)體系—胚胎胸腺器官培養(yǎng)(fetal thymus organ culture, FTOC)的建立和發(fā)展,為胸腺細(xì)胞發(fā)育、成熟及其相關(guān)調(diào)節(jié)機(jī)制的探討提供了有效的研究手段。 樹突狀細(xì)胞(dendritic cells, DCs)是機(jī)體中最主要的和最有效的抗原提呈細(xì)胞,對(duì)啟動(dòng)T細(xì)胞的免疫應(yīng)答起著至關(guān)重要的作用。胸腺作為中樞免疫器官,存在著胸腺樹突狀細(xì)胞(thymic dendritic cells, TDCs)。近年來,不斷有TDCs的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,TDCs在調(diào)控陰性選擇和誘導(dǎo)自身免疫耐受方面發(fā)揮著重要的作用。FMS樣酪氨酸激酶3配體(Fms-like tyrosine kinase 3 ligand, Flt3L)是一種重要的可促進(jìn)多能干細(xì)胞分化的細(xì)胞因子。體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)表明, Flt3L在誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞分化、發(fā)育方面發(fā)揮著重要的作用。本研究在成功建立FTOC實(shí)驗(yàn)體系的基礎(chǔ)上,利用該實(shí)驗(yàn)體系研究了Flt3L對(duì)胸腺T細(xì)胞及胸腺樹突狀細(xì)胞的分化發(fā)育的影響。 本論文分為兩部分。第一部分主要闡述了FTOC實(shí)驗(yàn)體系的建立,并在此基礎(chǔ)上研究細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-7(Interleukin-7, IL-7)和Flt3L對(duì)胸腺T細(xì)胞和胸腺樹突狀細(xì)胞分化發(fā)育的影響。首先是FTOC常規(guī)實(shí)驗(yàn)體系的建立,選取15.5～16.5dpc(day postcoitus)的孕鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,于實(shí)體顯微鏡下摘取胚胎胸腺,在組織器官培養(yǎng)皿中進(jìn)行FTOC常規(guī)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為Flt3L組、IL-7組和對(duì)照組,12d后收集各實(shí)驗(yàn)組經(jīng)FTOC培養(yǎng)所獲得的胸腺細(xì)胞,通過細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)細(xì)胞數(shù)目的變化,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面分子CD4、CD8、CD11c、B220、Ia等的表達(dá),通過光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。獲得以下實(shí)驗(yàn)結(jié)果:(1)細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示,添加外源性IL-7組的胸腺細(xì)胞數(shù)目明顯減少,而Flt3L組和對(duì)照組的胸腺細(xì)胞數(shù)目無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)的差異。(2)流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示:IL-7組胸腺CD4-CD8-雙陰性細(xì)胞及CD8+單陽(yáng)性細(xì)胞比例有所增加,而CD4+CD8+雙陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著下降,CD4+單陽(yáng)性細(xì)胞比例沒有明顯變化;Flt3L組胸腺T細(xì)胞大部分為CD4+CD8+雙陽(yáng)性細(xì)胞及CD4+?CD8+單陽(yáng)性細(xì)胞;Flt3L組的胸腺T細(xì)胞亞群分布與對(duì)照組無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)的差異。(3)形態(tài)學(xué)觀察顯示:Flt3L組和IL-7組的胸腺細(xì)胞中均可見一些聚集的有突起的具有樹突狀細(xì)胞形態(tài)特征的細(xì)胞存在,而對(duì)照組絕大部分為圓形的胸腺細(xì)胞。由此可見IL-7和Flt3L在胸腺T細(xì)胞及胸腺樹突狀細(xì)胞的分化發(fā)育中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。 第二部分研究利用常規(guī)FTOC實(shí)驗(yàn)體系并聯(lián)合懸滴培養(yǎng)方法,將小鼠骨髓來源的c-kit+造血干/祖細(xì)胞植入胸腺,從而探討Flt3L對(duì)小鼠骨髓源造血干/祖細(xì)胞向胸腺樹突狀細(xì)胞分化、發(fā)育過程的影響。摘取15.5～16.5dpc胎鼠的胸腺,用藥液2-脫氧鳥苷(2-deoxyguanosine, 2-dGuo)處理胸腺以去除胸腺中的造血細(xì)胞,隨后將骨髓來源的c-kit+造血干/祖細(xì)胞通過懸滴培養(yǎng)方法植入處理過的胸腺,最后將胸腺置于組織器官培養(yǎng)皿中,將含有和未含有細(xì)胞因子Flt3L的培養(yǎng)基分別滴加在胸腺小葉上,進(jìn)行FTOC培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和Flt3L組。12d后收集不同條件下FTOC培養(yǎng)獲得的胸腺細(xì)胞,通過流式細(xì)胞儀對(duì)胸腺細(xì)胞的表型進(jìn)行分析;將在不同條件下FTOC培養(yǎng)的獲得胸腺細(xì)胞分別進(jìn)行MACS分選,從而獲得胸腺樹突狀細(xì)胞兩亞群—髓系樹突狀細(xì)胞(B220-CD11c+, conventional dendritic cells, cDC)和漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(B220+CD11c+, plasmacytoid dendritic cells, pDC),再通過Giemsa染色法對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析,通過RT-PCR方法檢測(cè)其Toll樣受體的表達(dá),通過ELISA方法檢測(cè)其特異性細(xì)胞因子的分泌情況,再將經(jīng)FTOC培養(yǎng)獲得的胸腺cDC和胸腺pDC分別與異源的T細(xì)胞進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞反應(yīng),通過MTT法檢測(cè)T細(xì)胞的增殖。獲得以下實(shí)驗(yàn)結(jié)果:(1)流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示:與對(duì)照組相比較,Flt3L組樹突狀細(xì)胞和B細(xì)胞、NK細(xì)胞數(shù)量均有不同程度的增加。(2)Giemsa染色顯示:經(jīng)過CpG2216刺激成熟后,胸腺cDC和胸腺pDC均表現(xiàn)出成熟樹突狀細(xì)胞的形態(tài)特征。(3)RT-PCR分析顯示:CpG2216刺激后,胸腺cDC低表達(dá)或不表達(dá)TLR7和TLR9,而胸腺pDC高表達(dá)TLR7和TLR9。(4)ELISA分析顯示:CpG2216刺激后,小鼠的胸腺cDC中IFN-α和IL-12p70的分泌量均低于胸腺pDC。(5)MTT檢測(cè)表明,無CpG2006刺激時(shí),胸腺cDC和胸腺pDC刺激T細(xì)胞增殖的能力均比較弱;但添加CpG2006刺激后,胸腺cDC和胸腺pDC趨向于成熟,刺激T細(xì)胞增殖的能力均有所增強(qiáng)。由此可見,來自Flt3L組的胸腺細(xì)胞中的部分細(xì)胞不僅具有類似樹突狀細(xì)胞的形態(tài)和表達(dá)樹突狀細(xì)胞表面特異分子,而且也具有激發(fā)T細(xì)胞的作用。以上結(jié)果表明Flt3L能促進(jìn)胸腺樹突狀細(xì)胞的生成。 綜上所述,本研究成功建立了FTOC的實(shí)驗(yàn)體系,研究了Flt3L和IL-7對(duì)胸腺T細(xì)胞及胸腺樹突狀細(xì)胞分化發(fā)育的影響。并且在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步研究了Flt3L對(duì)小鼠骨髓源c-kit+造血干/祖細(xì)胞向胸腺樹突狀細(xì)胞分化發(fā)育過程的影響。通過該實(shí)驗(yàn)體系,可以在體外擴(kuò)增胸腺cDC和胸腺pDC,這將為體外研究胸腺樹突狀細(xì)胞的分化發(fā)育及其相關(guān)分子機(jī)理提供了有效的實(shí)驗(yàn)手段。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：1931095