本文選題：PIG11 + miRNA��； 參考：《南華大學》2010年碩士論文

【摘要】： 目的:構建人PIG11的miRNA表達載體pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR,建立低表達PIG11基因的HepG2細胞株,聯(lián)合采用本課題組前期已建立的PIG11蛋白穩(wěn)定高表達HepG2細胞株,探討PIG11蛋白表達對HepG2細胞凋亡的影響,以及ROS和Survivin、Caspase3、Caspase9蛋白表達在凋亡過程中的作用。闡明PIG11誘導細胞凋亡的分子機制。 方法:構建4個miRNA表達質粒,轉化至感受態(tài)細菌DH5α挑取克隆測序。在脂質體2000的協(xié)助下轉染HepG2細胞,經(jīng)BSD篩選,獲得穩(wěn)定PIG11蛋白低表達的HepG2細胞。RT-PCR和Western Blot分別從mRNA和蛋白質水平鑒定4組載體轉染HepG2細胞后PIG11的表達情況,從中選取干擾效果最好的1組作為PIG11蛋白低表達的HepG2細胞模型。故后續(xù)實驗分組為HepG2細胞、pLXSN-HepG2細胞(空載體組細胞)、pLXSN-PIG11-HepG2細胞(PIG11高表達組細胞)、miR-PIG11-HepG2細胞(PIG11低表達組細胞)、miR-NC-HepG2細胞(干擾錯義序列組細胞)。利用MTT法和平皿克隆形成實驗檢測細胞的生長情況;PI染色流式細胞術檢測其凋亡效應;DCFH-DA熒光探針標記細胞內(nèi)ROS,流式檢測ROS水平的改變;Western Blot測定Survivin、Caspase3、Caspase9蛋白的表達情況。 結果:成功構建4組人PIG11的miRNA表達載體pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR,基因測序正確。轉染后獲得穩(wěn)定細胞株,測定結果顯示轉染第4組干擾質粒的HepG2細胞PIG11 mRNA水平最低(p0.01),PIG11蛋白表達最低(p0.01)。實驗顯示:pLXSN-PIG11-HepG2細胞生長減慢(p0.01),miR-PIG11-HepG2細胞生長加快(p0.01),pLXSN-HepG2細胞、miR-NC-HepG2細胞、HepG2細胞各組間生長差異無顯著性。 結果顯示:HepG2細胞、pLXSN-HepG2細胞、pLXSN-PIG11-HepG2細胞、miR-PIG11-HepG2細胞、miR-NC-HepG2細胞的凋亡率分別為5.72%±0.81、5.34%±0.60、34.83%±2.29、1.34%±0.71、5.10%±0.40。pLXSN-PIG11-HepG2細胞凋亡率比其它各組增高(p0.01),miR-PIG11-HepG2細胞凋亡率降低(p0.01)。 HepG2細胞、pLXSN-HepG2細胞、pLXSN-PIG11-HepG2細胞、miR-PIG11-HepG2細胞、miR-NC-HepG2細胞的ROS水平分別為5.52±0.97、4.92±0.71、15.71±0.82、2.39±0.22、5.12±0.15,pLXSN-PIG11-HepG2細胞ROS水平高于其余各組(p0.05),miR-PIG11-HepG2細胞ROS水平低于其余各組(p0.05)。使用ROS清除劑NAC后,各組細胞內(nèi)的ROS水平降低,流式凋亡檢測各組細胞凋亡顯示pLXSN-PIG11-HepG2細胞凋亡率為16.2%±1.18較原來降低(p0.05),余各組細胞凋亡率變化不明顯。使用MPTP抑制劑CsA后, pLXSN-PIG11-HepG2細胞組ROS水平降低至8.12±0.92(p0.05),余各組細胞變化不明顯。 pLXSN-PIG11-HepG2細胞中Caspase3、Caspase9蛋白表達上調(diào)(p0.01),Survivin蛋白表達下調(diào)(p0.01),miR-PIG11 -HepG2細胞中Caspase3、Caspase9蛋白表達下調(diào)(p0.01),Survivin蛋白表達上調(diào)(p0.01)。 結論:建立了PIG11低表達的穩(wěn)定細胞模型;PIG11高表達能抑制HepG2細胞生長和誘導其凋亡;PIG11誘導細胞凋亡與胞內(nèi)ROS變化和Caspase3,9蛋白表達上調(diào)及Survivin蛋白表達下調(diào)有關。
[Abstract]:Objective: to construct a miRNA expression vector of human PIG11, pcDNA? 6.2-GW/EmGFPmiR, to establish a HepG2 cell line with low expression of PIG11 gene, and to combine the stable and high expression of HepG2 cell lines with the previously established PIG11 protein in our group, and to explore the effect of PIG11 protein expression on the apoptosis of HepG2 cells, as well as ROS and Survivin, and the expression of the protein in the apoptosis of HepG2 cells. The role of PIG11 in inducing apoptosis is elucidated.
Methods: 4 miRNA expression plasmids were constructed and converted to DH5 alpha of receptive bacteria to clone and sequence. HepG2 cells were transfected under the assistance of liposome 2000. The expression of.RT-PCR and Western Blot, a HepG2 cell with low expression of PIG11 protein, was obtained, and the expression of PIG11 was identified from mRNA and protein levels, respectively, from mRNA and protein levels. The 1 groups with the best interference effect were selected as the HepG2 cell model with low expression of PIG11 protein, so the follow-up experiments were divided into HepG2 cells, pLXSN-HepG2 cells (unloaded group cells), pLXSN-PIG11-HepG2 cells (PIG11 high expression group cells), miR-PIG11-HepG2 cells (PIG11 low expression group cells), miR-NC-HepG2 cells (interfering missense sequence group fine) The cell growth of the cells was detected by the MTT method, and the apoptosis effect was detected by PI staining flow cytometry; the DCFH-DA fluorescence probe marked the intracellular ROS, the flow cytometry was used to detect the changes of ROS level; Western Blot was used to determine the expression of Survivin, Caspase3, Caspase9 protein.
Results: the miRNA expression vector pcDNA? 6.2-GW/EmGFPmiR of 4 groups of human PIG11 was successfully constructed, and the gene was sequenced correctly. The stable cell line was obtained after transfection. The results showed that the PIG11 mRNA level of HepG2 cells transfected with fourth groups of plasmids was the lowest (P0.01), and the expression of PIG11 protein was the lowest (P0.01). The experiment showed that pLXSN-PIG11-HepG2 cell growth slowed (P0.01), The growth of R-PIG11-HepG2 cells was accelerated (P0.01), but there was no significant difference in the growth of pLXSN-HepG2 cells, miR-NC-HepG2 cells and HepG2 cells.
The results showed that the apoptosis rates of HepG2 cells, pLXSN-HepG2 cells, pLXSN-PIG11-HepG2 cells, miR-PIG11-HepG2 cells and miR-NC-HepG2 cells were 5.72% + 0.81,5.34% + 0.60,34.83% + 2.29,1.34% + 0.71,5.10% + 0.40.pLXSN-PIG11-HepG2 cells (P0.01), and the apoptosis rate of miR-PIG11-HepG2 cells decreased.
The ROS levels of HepG2 cells, pLXSN-HepG2 cells, pLXSN-PIG11-HepG2 cells, miR-PIG11-HepG2 cells and miR-NC-HepG2 cells were 5.52 + 0.97,4.92 + 0.71,15.71 + 0.82,2.39 + 0.22,5.12 + 0.15 respectively. PLXSN-PIG11-HepG2 cell ROS level was higher than that of the rest of the other groups. After the removal of NAC, the level of ROS in each group decreased. Apoptosis in each group showed that the apoptosis rate of pLXSN-PIG11-HepG2 cells was 16.2% + 1.18 than that of the original (P0.05), and the apoptosis rate of the remaining groups was not obvious. After CsA, the ROS level of the pLXSN-PIG11-HepG2 cell group decreased to 8.12 + 0.92 (P0.05), and the remaining groups were fine. The change of cell was not obvious.
In pLXSN-PIG11-HepG2 cells, the expression of Caspase3, Caspase9 protein was up regulated (P0.01), the expression of Survivin protein was downregulated (P0.01), Caspase3 in miR-PIG11 -HepG2 cells, down regulation of Caspase9 protein expression (P0.01), and up regulation of Survivin protein expression.
Conclusion: a stable cell model of low expression of PIG11 is established. High expression of PIG11 can inhibit the growth and induce apoptosis of HepG2 cells. PIG11 induced apoptosis is related to the changes in intracellular ROS, up regulation of Caspase3,9 protein expression and down regulation of the expression of Survivin protein.
【學位授予單位】：南華大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R363

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