本文選題：間充質(zhì)干細(xì)胞 + 異體T淋巴細(xì)胞�。� 參考：《河北醫(yī)科大學(xué)》2010年碩士論文

【摘要】： 目的:利用異基因造血干細(xì)胞移植治療惡性血液病己經(jīng)越來(lái)越成為血液病的常規(guī)治療手段,而異基因干細(xì)胞移植后GVHD是限制移植技術(shù)發(fā)展的最大障礙。如何防治GVHD已經(jīng)成為這一領(lǐng)域研究的重點(diǎn)。 研究顯示,間充質(zhì)干細(xì)胞可能有抑制GVHD作用。在BMT的同時(shí)植入包含供者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在內(nèi)的骨髓作為造血微環(huán)境,發(fā)生GVHD的危險(xiǎn)性顯著降低。進(jìn)一步研究提示體外培養(yǎng)擴(kuò)增的人間充質(zhì)干細(xì)胞也可以減輕GVHD反應(yīng),提高異基因干細(xì)胞移植的成功率。 我們通過(guò)體外培養(yǎng)擴(kuò)增HBM-MSCs,并與純化后的異體外周血T細(xì)胞進(jìn)行接觸和非接觸共培養(yǎng),觀察其對(duì)PHA刺激的T細(xì)胞增殖及調(diào)節(jié)T細(xì)胞亞群數(shù)量的影響,探討MSCs抑制GVHD可能的作用機(jī)制,為MSCs在GVHD防治中應(yīng)用提供理論依據(jù)。 方法: 1 BMMSCs的培養(yǎng)、擴(kuò)增及鑒定 1.1 BMMSCs的分離、培養(yǎng)及擴(kuò)增:取肝素抗凝非惡性病患者骨髓液,Ficoll分離液分離單個(gè)核細(xì)胞,接種于25cm2一次性無(wú)菌塑料培養(yǎng)瓶中,37℃,5%CO2飽和濕度培養(yǎng)。72小時(shí)后首次全量換液,此后每3-4天換液一次。待貼壁細(xì)胞層融合達(dá)80-90%以上時(shí),胰酶消化傳代。 1.2生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)定:分別取P1、P3、P5生長(zhǎng)良好細(xì)胞接種于96孔板,MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性,每代細(xì)胞連續(xù)觀察8天。將每天的OD值取均值,做生長(zhǎng)曲線(xiàn)分析。 1.3 BMMSCs鑒定 1.3.1倒置顯微鏡下直接活體觀察。 1.3.2取P3細(xì)胞,做細(xì)胞爬片,瑞氏吉姆薩染色,顯微鏡下觀察。 1.3.3收集P3、P5細(xì)胞,選取CD34-PE、CD45-PerCP、CD44-FITC單抗,流式細(xì)胞儀進(jìn)行免疫表型測(cè)定。 2 T細(xì)胞分離純化 2.1外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMNC)分離:取新鮮健康獻(xiàn)血志愿者外周血過(guò)濾的白細(xì)胞,Ficoll分離液分離單個(gè)核細(xì)胞。 2.2 T淋巴細(xì)胞純化:取處理后的尼龍毛柱,加入PBMNC懸液,37℃,5%CO2飽和濕度孵育1小時(shí),純化T淋巴細(xì)胞。 2.3 T細(xì)胞純度檢測(cè):取尼龍毛柱純化前和純化后細(xì)胞,選取CD3-PerCP、CD4-FITC、CD25-PE單克隆抗體,流式細(xì)胞儀檢測(cè)免疫表型。 3 MSCs與T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng) 3.1實(shí)驗(yàn)分組A:BMMSCs空白對(duì)照組; B:BMMSCs+PHA對(duì)照組; C:BMMSCs+T細(xì)胞接觸培養(yǎng)組; D:BMMSCs+T細(xì)胞接觸培養(yǎng)PHA刺激組; E:BMMSCs+T細(xì)胞非接觸培養(yǎng)組; F:BMMSCs+T細(xì)胞非接觸培養(yǎng)PHA刺激組; G:T細(xì)胞空白對(duì)照組; H:T細(xì)胞PHA刺激對(duì)照組;每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。MSCs:T為1:20。PHA濃度50ug/ml。 3.2 MSCs制備:取P4代生長(zhǎng)良好MSCs,按分組接種于6孔板,設(shè)3復(fù)孔,同時(shí)按相同條件和密度接種MSC于96孔板,設(shè)6復(fù)孔,待細(xì)胞完全貼壁后,以60Coγ5Gy照射去增殖處理。 3.3 MSCs接觸培養(yǎng)對(duì)T細(xì)胞的影響觀察:接種T細(xì)胞于已制備好MSCs的6孔板內(nèi),用于T細(xì)胞表型和PCR檢測(cè);同時(shí)按相同條件和密度接種于已制備好MSC的96孔板內(nèi),用于細(xì)胞增殖檢測(cè)。加入PHA作為刺激原,同時(shí)分別設(shè)置無(wú)PHA刺激組作為對(duì)照。 3.4 MSCs非接觸培養(yǎng)對(duì)T細(xì)胞的影響觀察:在已制備好MSCs的6孔板內(nèi)放置Transwell小室,接種T細(xì)胞于小室內(nèi),用于T細(xì)胞表型和PCR檢測(cè)。加入PHA作為刺激原,同時(shí)設(shè)置無(wú)PHA刺激組作為對(duì)照。 3.5對(duì)照組:按相同條件和密度設(shè)置單獨(dú)T細(xì)胞和單獨(dú)MSCs培養(yǎng)組,加入PHA作為刺激原,同時(shí)分別設(shè)置無(wú)PHA刺激組作為對(duì)照。 4 T細(xì)胞增殖檢測(cè):MTT法檢測(cè)T細(xì)胞增殖活性。 5 CD4、CD25檢測(cè):選取CD3-PerCP、CD4-FITC、CD25-PE單克隆抗體,流式細(xì)胞儀分析,檢測(cè)不同培養(yǎng)條件下免疫表型變化。 6 Foxp3mRNA表達(dá)檢測(cè) 6.1取共培養(yǎng)后細(xì)胞,提取總RNA。取提取物測(cè)OD260/OD280。RNA電泳檢測(cè)RNA完整性。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。 6.2 realtime PCR檢測(cè)不同培養(yǎng)條件下Foxp3 mRNA表達(dá)變化。Foxp3引物:上游(5'→3') : GTCTGGGCTCATAGGCACATT ,下游(5'→3') :ATGGCGTTCTGTGGAAGGC,片段長(zhǎng)度116bp。β-actin引物:上游(5'→3') :CTGGCACCACACCTTCTACAAT,下游(5'→3'):AATGTCACG CACGATTTCCCGC,片段長(zhǎng)度382bp。PCR反應(yīng)體系為25μl ,包括cDNA2μl,上下游引物各1μl,2.5×Real MasterMix 10μl,20×SBYR GREEN 1.25μl,DEPC水補(bǔ)足至25μl。反應(yīng)條件:95℃,3min×1cycle預(yù)變性;94℃,25sec;54℃,30sec×35cycles擴(kuò)增;95℃,15sec;60℃,1min;95℃,15sec;60℃,15sec×1cycle溶解曲線(xiàn)分析。所有檢測(cè)實(shí)驗(yàn)均包含一個(gè)無(wú)模板的陰性對(duì)照以排除假陽(yáng)性結(jié)果。分析樣本Ct值,以β-actin表達(dá)量作為內(nèi)對(duì)照,結(jié)果采用2[Ct(β-actin)-Ct(Foxp3)]表示。 7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 SPSS 17.0軟件分析,分組資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,進(jìn)行單因素方差分析,Dunnett’S T3法進(jìn)行兩兩比較,以P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果: 1骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增及生物學(xué)特性 原代細(xì)胞接種后4 h部分圓形細(xì)胞開(kāi)始貼壁,24 h可見(jiàn)貼壁細(xì)胞伸展為呈纖維狀,72小時(shí)后可見(jiàn)貼壁細(xì)胞呈克隆樣生長(zhǎng), 8～10d后集落逐漸增多并融合成片,約兩周左右細(xì)胞融合成單層,呈旋渦狀或平行排列。傳代細(xì)胞24h可完全貼壁、伸展,并保持原代細(xì)胞形態(tài)特征,均勻散在分布生長(zhǎng)。P3以后細(xì)胞生長(zhǎng)速度加快,P9以后細(xì)胞生長(zhǎng)減慢。 P3細(xì)胞瑞-吉染色細(xì)胞呈纖維狀生長(zhǎng),旋渦狀排列,細(xì)胞形態(tài)均一,胞體細(xì)小,胞核致密,核仁可見(jiàn)。對(duì)1、3、5代細(xì)胞進(jìn)行生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)定顯示,1-2d細(xì)胞增殖較慢,處于潛伏期;3-6d是細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,7d后細(xì)胞生長(zhǎng)速度減慢進(jìn)入平臺(tái)期。本培養(yǎng)體系中細(xì)胞倍增時(shí)間約為40h。 免疫熒光分析細(xì)胞高表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)記CD44(P3、P5代平均陽(yáng)性率分別為93.61%、96.03%),低表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)記CD34 (P3、P5代平均陽(yáng)性率分別為1.56%、1.26%)和CD45(P3、P5代平均陽(yáng)性率分別為5.16%、1.0%)。符合MSC的免疫學(xué)特征。 2 T細(xì)胞觀察及表型檢測(cè) T細(xì)胞形態(tài)呈小圓形,流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示尼龍毛純化前CD3平均陽(yáng)性率24.2%,純化后CD3平均陽(yáng)性率86.43%。 3 MSCs與T細(xì)胞共培養(yǎng)形態(tài)學(xué)觀察 光鏡下觀察A(MSC單獨(dú)培養(yǎng))、B(MSC+PHA培養(yǎng))組無(wú)明顯區(qū)別,提示PHA刺激對(duì)MSC無(wú)影響。PHA刺激后T細(xì)胞成團(tuán)聚集生長(zhǎng),H(T+PHA培養(yǎng))組細(xì)胞聚集生長(zhǎng)最為顯著,D(MSC+T+PHA接觸培養(yǎng))、F(MSC+T+PHA非接觸培養(yǎng))組可見(jiàn)細(xì)胞聚集生長(zhǎng),均不如H組明顯,而F組較D組明顯。無(wú)PHA刺激的C(MSC+T接觸培養(yǎng))、E(MSC+T非接觸培養(yǎng))、G(T細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng))組未見(jiàn)T細(xì)胞聚集生長(zhǎng),組間無(wú)明顯區(qū)別。PHA刺激可引起T細(xì)胞增殖,但MSC存在的條件下,PHA刺激的T細(xì)胞增殖明顯減低,而MSC接觸培養(yǎng)的T細(xì)胞增殖減低較非接觸培養(yǎng)明顯。 4 MSC對(duì)T細(xì)胞增殖的影響 無(wú)PHA刺激的C、E、G組OD值分別為0.033±0.013、0.052±0.04、0.081±0.024,而PHA刺激的D、F、H組OD值分別為0.14±0.023、0.234±0.027、0.948±0.076。C、E、G組T細(xì)胞增殖均低于D、F、H組(0.01P0.05)。提示PHA在各種情況下均可刺激T細(xì)胞增殖。 無(wú)PHA刺激的C、E、G組中,C組T細(xì)胞增殖低于G組(0.01P0.05),而C組與E組、E組與G組間差異不明顯(P0.05),以G組為對(duì)照,C、E組增殖抑制率分別為(55.05±5.55)%、(30.73±2.42)%。提示MSC與T細(xì)胞共培養(yǎng)不會(huì)刺激T細(xì)胞增殖,在無(wú)PHA刺激條件下MSC接觸培養(yǎng)對(duì)T細(xì)胞的活性有一定抑制作用,可能與誘導(dǎo)了部分T細(xì)胞的凋亡有關(guān),而非接觸培養(yǎng)無(wú)明顯抑制作用。 PHA刺激的D、F、H組間比較差異均具有顯著性(P0.01),加MSC共培養(yǎng)的D、F組T細(xì)胞增殖明顯低于無(wú)MSC的H組,而接觸培養(yǎng)的D組增殖低于非接觸培養(yǎng)的F組,以H組為對(duì)照,D、F組增殖抑制率分別為(85.20±2.24)%、(75.26±2.90)%。MSC接觸培養(yǎng)和非接觸培養(yǎng)均對(duì)PHA刺激的T細(xì)胞增殖有明顯抑制作用,而接觸培養(yǎng)抑制作用強(qiáng)于非接觸培養(yǎng),提示MSC可能通過(guò)細(xì)胞間接觸和分泌可溶性因子(非接觸作用)兩種途徑抑制T細(xì)胞增殖,其中細(xì)胞間接觸途徑可能作用更強(qiáng)。 5 MSC對(duì)T細(xì)胞CD25表達(dá)的影響 CD25是淋巴細(xì)胞表面表達(dá)相對(duì)較早的標(biāo)記,可作為T(mén)細(xì)胞增殖活性檢測(cè)的一個(gè)指標(biāo)。無(wú)PHA刺激的C、E、G組CD25陽(yáng)性細(xì)胞比例分別為(4.240±0.402)%、(3.047±0.332)%、(3.107±0.391)%,而PHA刺激的D、F、H組CD25陽(yáng)性細(xì)胞比例分別為(32.713±1.343)%、(24.157±1.854)%、(51.243±0.91)%。C、E、G組CD25陽(yáng)性細(xì)胞比例均低于D、F、H組(P0.01)。提示PHA刺激后T淋巴細(xì)胞活化明顯。 無(wú)PHA刺激的C、E、G組中,MSC接觸/非接觸培養(yǎng)、T細(xì)胞空白對(duì)照組CD25陽(yáng)性細(xì)胞比例均無(wú)明顯差異(P0.05)。提示MSC不會(huì)刺激共培養(yǎng)體系中的T細(xì)胞活化,PHA是T細(xì)胞活化的主要因素;無(wú)PHA刺激條件下,MSC對(duì)T細(xì)胞活化無(wú)明顯影響。 PHA刺激的D、F、H組中,接觸培養(yǎng)的D、非接觸培養(yǎng)的F組CD25陽(yáng)性細(xì)胞比例明顯低于無(wú)MSC的H組(P0.01),而D組CD25陽(yáng)性細(xì)胞比例高于F組(0.01P0.05)。提示MSC接觸和非接觸培養(yǎng)均對(duì)PHA刺激的T細(xì)胞活化有抑制作用,非接觸培養(yǎng)較接觸培養(yǎng)抑制作用明顯,可能非接觸培養(yǎng)對(duì)CD25陽(yáng)性細(xì)胞的抑制更強(qiáng)。 6 MSC對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的影響 6.1 CD4CD25檢測(cè) CD4CD25雙陽(yáng)性是鑒別調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的標(biāo)記之一。無(wú)PHA刺激的C、E、G組CD4CD25雙陽(yáng)性細(xì)胞比例分別為(5.010±0.415)%、(3.403±0.282)%、(3.470±0.310)%,而PHA刺激的D、F、H組CD4CD25雙陽(yáng)性細(xì)胞比例分別為(45.623±2.624)%、(27.330±1.901)%、(25.103±1.835)%。C、E、G組CD4CD25雙陽(yáng)性細(xì)胞比例均低于D、F、H組(P0.01)。提示PHA刺激后調(diào)節(jié)T細(xì)胞比例增加。 無(wú)PHA刺激的C、E、G組中,MSC接觸/非接觸培養(yǎng)、無(wú)MSC組中的T細(xì)胞CD4CD25雙陽(yáng)性細(xì)胞比例差異均不明顯(P0.05),提示本實(shí)驗(yàn)中PHA刺激是T細(xì)胞調(diào)節(jié)T細(xì)胞亞群比例增高的原因之一,無(wú)PHA刺激條件下,MSC對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群的比例無(wú)影響。 PHA刺激的D、F、H組中,加MSC共培養(yǎng)的D組CD4CD25雙陽(yáng)性細(xì)胞比例明顯高于非接觸培養(yǎng)的F組和無(wú)MSC的H組(P0.01),而非接觸培養(yǎng)的F組和無(wú)MSC的H組間差別不顯著(P0.05)。PHA刺激后的活化細(xì)胞中,CD4CD25雙陽(yáng)性細(xì)胞比例增高,但MSC接觸培養(yǎng)組增高更明顯,提示MSC接觸培養(yǎng)對(duì)PHA刺激的T細(xì)胞免疫表型變化有影響,可能上調(diào)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞,而非接觸培養(yǎng)上調(diào)作用不明顯。 6.2 Foxp3mRNA表達(dá)檢測(cè) Foxp3是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的的特異性標(biāo)記。無(wú)PHA刺激的C、E、G組Foxp3mRNA表達(dá)量分別為1.91±0.084、1.84±0.125、1.86±0.106,而PHA刺激的D、F、H組Foxp3mRNA表達(dá)量分別為2.58±0.089、2.35±0.044、2.09±0.1。C、E、G組Foxp3mRNA表達(dá)量低于D、F組(0.01P0.05),而與H無(wú)明顯區(qū)別(P0.05)。提示單純PHA刺激可能對(duì)Foxp3mRNA表達(dá)無(wú)影響。 無(wú)PHA刺激的C、E、G組中,MSC接觸/非接觸培養(yǎng)、無(wú)MSC組中的T細(xì)胞Foxp3mRNA表達(dá)量均無(wú)明顯差異(P0.05)。提示無(wú)PHA刺激條件下,MSC不影響T細(xì)胞Foxp3mRNA的表達(dá)。 PHA刺激的D、F、H中,接觸培養(yǎng)的D組Foxp3mRNA表達(dá)量高于無(wú)MSC的H組(0.01P0.05)。而D組與非接觸培養(yǎng)的F組、F組和H組間無(wú)顯著差異(P0.05)。提示MSC接觸培養(yǎng)能夠使T細(xì)胞Foxp3mRNA表達(dá)上調(diào),可能增加調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例,而非接觸培養(yǎng)對(duì)Foxp3mRNA表達(dá)的影響不明顯。 結(jié)論: 1 MSCs接觸和非接觸培養(yǎng)均可明顯抑制PHA刺激的T細(xì)胞增殖,接觸培養(yǎng)的抑制作用強(qiáng)于非接觸培養(yǎng)。 2 MSCs可能通過(guò)細(xì)胞間接觸和分泌可溶性分子兩種途徑參與對(duì)T細(xì)胞增殖的抑制。 3 MSCs與T淋巴細(xì)胞接觸培養(yǎng)可以上調(diào)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例,而非接觸培養(yǎng)上調(diào)不明顯。 4 MSCs與T淋巴細(xì)胞接觸培養(yǎng)可以上調(diào)T細(xì)胞Foxp3mRNA表達(dá)而非接觸培養(yǎng)上調(diào)不明顯。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類(lèi)號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1893415