本文選題：SSeCKS + 蛋白激酶C��； 參考：《南通大學(xué)》2008年碩士論文

【摘要】： [研究背景及目的] 中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system,CNS)內(nèi)炎癥病理過程是以膠質(zhì)細(xì)胞的活化和周圍炎癥細(xì)胞的浸潤為主要特征的。作為CNS中數(shù)量最多的細(xì)胞類型,星形膠質(zhì)細(xì)胞在維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要的作用。當(dāng)機(jī)體遭受外來炎癥因子或微生物刺激時,星形膠質(zhì)細(xì)胞被迅速激活并產(chǎn)生大量的炎性因子,這些細(xì)胞因子具有雙向的調(diào)節(jié)作用:一方面,它們可以誘導(dǎo)更大量炎癥因子在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的產(chǎn)生,例如趨化因子、其它細(xì)胞因子、黏附分子等,并由此調(diào)節(jié)機(jī)體對外來刺激的免疫應(yīng)答過程;另一方面,這些生物活性因子的過度釋放會導(dǎo)致反應(yīng)性膠質(zhì)增生以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的破壞,阻礙軸突的再生,影響神經(jīng)元的活性。因此,對炎癥反應(yīng)的適當(dāng)調(diào)節(jié)對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)在免疫應(yīng)答過程中穩(wěn)態(tài)的維持具有重要的意義。 研究表明,多種信號調(diào)節(jié)機(jī)制參與調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化過程。近幾年的研究指出,蛋白激酶C(protein kinase C , PKC)信號途徑在星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活過程中發(fā)揮重要作用,并參與調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞分化、遷移以及細(xì)胞因子的釋放等過程。而這種調(diào)節(jié)作用的發(fā)揮主要是依賴于PKC底物的錨定作用對其空間結(jié)構(gòu)以及亞細(xì)胞定位的改變。我們所說的AKAP(A Kinase Anchoring Protein)家族的蛋白分子以及蛋白激酶C錨定蛋白就是這種具有錨定功能的蛋白,它們可以作為一種連接蛋白與激酶相結(jié)合并將其引導(dǎo)至胞內(nèi)確定的結(jié)構(gòu)上。本課題的研究對象SSeCKS就是錨定蛋白的一種,該分子最初被認(rèn)為是有絲分裂的負(fù)性調(diào)節(jié)分子,是PKC的重要底物之一。作為AKAP蛋白家族的一員,SSeCKS的主要效應(yīng)結(jié)構(gòu)域可競爭性結(jié)合纖維狀肌動蛋白(F-actin),鈣調(diào)蛋白(calmodulin,CaM),細(xì)胞周期蛋白D(cyclinD),羧基端有蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。因此,SSeCKS可以通過選擇性結(jié)合一些信號蛋白,整合細(xì)胞內(nèi)信號。Lin等人的研究表明,PKCα可磷酸化SSeCKS并影響其細(xì)胞內(nèi)定位;Kitamura等人發(fā)現(xiàn),在炎癥反應(yīng)過程中,SSeCKS在肺、心臟、腎臟、腦組織中的表達(dá)明顯增高,故認(rèn)為SSeCKS是一種炎癥反應(yīng)蛋白;Sae-Won Lee等研究表明,SSeCKS在星形膠質(zhì)細(xì)胞中有表達(dá),并在血腦屏障功能的成熟和維護(hù)中發(fā)揮重要作用。這些證據(jù)提示SSeCKS可能與炎癥過程中PKC介導(dǎo)的膠質(zhì)細(xì)胞的活化有關(guān)。 本研究主要對腹腔注射LPS后SSeCKS在腦組織的表達(dá)、定位情況進(jìn)行了分析,并探討了該分子在炎癥活化星形膠質(zhì)細(xì)胞過程中的作用與相關(guān)機(jī)制,為中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥的治療提供了新的思路。 [方法] 1.建立LPS致傷大鼠炎癥模型。 2.運用Real-time PCR、Western blot的方法檢測腦組織中SSeCKS表達(dá)的時空變化,運用免疫熒光雙標(biāo),觀察SSeCKS在腦組織的細(xì)胞定位;分析星形膠質(zhì)細(xì)胞活化與SSeCKS表達(dá)水平之間的相關(guān)性。 3.分離培養(yǎng)并純化大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞。在細(xì)胞水平,運用Real-time PCR、Western blot、激光共聚焦等技術(shù),檢測LPS對SSeCKS表達(dá)、亞細(xì)胞定位的影響;分析炎癥刺激,SSeCKS的表達(dá)水平以及PKC活性三者之間的相關(guān)性。 4.運用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建SSeCKS RNA干擾質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染細(xì)胞。運用免疫細(xì)胞熒光,Western blot,ELISA,流式細(xì)胞儀(Fluorescein activated cell sorter,FACS),免疫沉淀等方法分析干擾SSeCKS表達(dá)對活化過程中星形膠質(zhì)細(xì)胞生物合成以及增殖水平的影響以及相關(guān)的信號傳遞機(jī)制。 [結(jié)果] 1. 1)LPS致傷大鼠后早期, SSeCKS在腦組織中反應(yīng)性表達(dá)上調(diào),磷酸化水平增高。 2)正常狀態(tài)下,SSeCKS在腦組織中散在分布,高表達(dá)于神經(jīng)元。LPS腹腔注射后,SSeCKS在星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)上調(diào)。 3)在體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞中,LPS、IL-1β、TNF-α作用后,細(xì)胞內(nèi)SSeCKS表達(dá)水平和磷酸化水平改變;與此同時,SSeCKS在細(xì)胞內(nèi)重新分布:由胞漿向核周遷移,于胞膜足突濃集。PKC的抑制劑可以阻斷SSeCKS在細(xì)胞內(nèi)的重排及磷酸化水平的上調(diào)。 2. 1)LPS可誘導(dǎo)TNF-α在星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)合成,該過程受到PKC-細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(Extracellular signal regulating kinase,ERK)信號途徑的調(diào)節(jié)。 2)SSeCKS基因沉默可抑制LPS作用后星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)TNF-α的合成和分泌。 3)SSeCKS基因沉默可抑制LPS作用后星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)ERK的活性上調(diào)。 3. 1)TNF-α能誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖。經(jīng)典型PKC抑制劑G?6976可大幅度阻斷該效應(yīng),廣譜性的PKC抑制劑G?6983或PI3K抑制劑LY294002幾乎能完全抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖效應(yīng);而新型PKCδ抑制劑Rotterin無明顯抑制作用。 2)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖水平與SSeCKS的相對磷酸化水平高度正相關(guān)(r=0.905,P=0.02)。 3)PKC活性的喪失對TNF-α所誘導(dǎo)的Akt的磷酸化無明顯影響;同樣,抑制PI3K的活性不能影響TNF-α作用后SSeCKS磷酸化水平的上調(diào)。PKC-SSeCKS和PI3K-Akt相對獨立的影響TNF-α所誘導(dǎo)的增殖信號。 [結(jié)論] 1.正常狀態(tài)下,SSeCKS在腦組織中散在分布。LPS作用后該分子反應(yīng)性表達(dá)水平和活性均發(fā)生改變,提示該分子作為一種炎癥反應(yīng)蛋白,參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)。 2.炎癥因子作用后,SSeCKS在星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)和定位發(fā)生改變;其磷酸化水平和細(xì)胞內(nèi)定位的變化依賴于PKC的活性,提示該分子可能參與PKC介導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞活化信號的傳遞。 3. LPS可誘導(dǎo)TNF-α在星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)合成和分泌,該過程受到PKC-ERK信號途徑的調(diào)節(jié)。 4. SSeCKS的表達(dá)降低可影響LPS作用后星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)ERK磷酸化水平的上調(diào)和TNF-α的合成與分泌。提示該分子可能作為一個中介分子影響炎癥信號從PKC到ERK的傳遞。 5. SSeCKS參與調(diào)節(jié)TNF-α誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的炎性增殖過程。TNF-α刺激后SSeCKS的廣泛磷酸化可能是促成星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖的原因之一。 6. PKC-SSeCKS和PI3K-Akt均能影響TNF-α所誘導(dǎo)的增殖信號的傳遞,它們之間沒有明顯的上下游關(guān)系,但卻能互相牽制,提示PKC-SSeCKS和PI3K-Akt信號通路可能在下游存在交集。
[Abstract]:Background and purpose of research



The inflammatory and pathological processes in the central nervous system ( CNS ) are mainly characterized by the activation of glial cells and infiltration of peripheral inflammatory cells . Astrocytes play an important role in maintaining the homeostasis of the central nervous system .



In recent years , it is suggested that the protein kinase C ( PKC ) signaling pathway plays an important role in the activation of astrocytes and plays an important role in regulating the differentiation , migration of astrocytes and the release of cytokines .



In this study , the expression and localization of SSeCKS after intraperitoneal injection of LPS were analyzed , and the role and mechanism of the molecule in the activation of astrocytes were discussed , and a new idea was provided for the treatment of inflammation of the central nervous system .



Methodology



1 . To establish an inflammatory model of LPS - induced injury in rats .



2 . Using the method of Real - time PCR and Western blot to detect the temporal and temporal changes of SSeCKS expression in brain tissue , the cellular localization of SSeCKS in brain tissue was observed by immunofluorescence double standard , and the correlation between activation of astrocytes and the expression level of SSeCKS was analyzed .



3 . The effects of LPS on SSeCKS expression and subcell localization were detected by means of real - time PCR , Western blot and laser confocal technique , and the correlation between the expression level of SSeCKS and PKC activity was analyzed .



4 . Using molecular biology technique to construct SSeCKS RNA interference plasmid and transfected cells . The effects of interfering SSeCKS expression on the biosynthesis and proliferation of astrocytes in the activation process were analyzed by means of immunofluorescence , Western blot , ELISA , flow cytometry ( FACS ) , immunoprecipitation and so on .



The result is not valid .



1.1 ) In the early stage of LPS - induced injury , SSeCKS was up - regulated in brain tissue , and its phosphorylation level was increased .



2 ) In normal state , SSeCKS was distributed in brain tissue and expressed in neurons . After LPS injection , SSeCKS was up - regulated in astrocytes .



3 ) In cultured astrocytes , the level of SSeCKS expression and the level of phosphorylation were changed after LPS , IL - 1尾 and TNF - 偽 . At the same time , SSeCKS was redistributed in the cells : the cytoplasm was migrated to the nucleus around the nucleus , and the concentration of SSeCKS was concentrated . The inhibitor of PKC could block the up - regulation of the rearrangement and phosphorylation of SSeCKS in the cells .



2.1 ) LPS can induce the synthesis of TNF - 偽 in astrocytes , which is regulated by PKC - extracellular signal regulating kinase ( ERK ) signaling pathway .



2 ) SSeCKS gene silencing can inhibit the synthesis and secretion of TNF - 偽 in astrocytes after LPS .



3 ) The silencing of SSeCKS gene could inhibit the increase of ERK activity in astrocytes after LPS .



3.1 ) TNF - 偽 can induce the proliferation of astrocytes . A typical PKC inhibitor , G ? 6976 , can significantly block the effect , and the broad - spectrum PKC inhibitor G ? 6983 or the inhibitor of kinase ( LY294003 ) can inhibit the proliferation of astrocytes completely ; and the novel PKC 未 inhibitor has no obvious inhibitory effect on Rotterin .



2 ) The proliferation level of astrocytes was positively correlated with the relative phosphorylation level of SSeCKS ( r = 0.905 , P = 0.02 ) .



3 ) The loss of PKC activity had no significant effect on the phosphorylation of TNF - a - induced phosphorylation of SSeCKS . Similarly , the inhibition of PI3 activity did not affect the up - regulation of the phosphorylation level of SSeCKS after TNF - 偽 .



Conclusion



1 . In normal state , SSeCKS is dispersed in brain tissue . After LPS , the expression level and activity of this molecule change , suggesting that the molecule acts as an inflammatory response protein and participates in the inflammatory reaction of the central nervous system .



2 . After the action of inflammatory factors , the expression and localization of SSeCKS in astrocytes changed ; its phosphorylation level and intracellular localization depended on PKC activity , suggesting that the molecule might participate in PKC - mediated activation of astrocytes .



3 . LPS can induce the synthesis and secretion of TNF - 偽 in astrocytes , which is regulated by PKC - ERK signaling pathway .



4 . The reduction of SSeCKS can affect the up - regulation of ERK phosphorylation and the synthesis and secretion of TNF - 偽 in astrocytes after LPS . It is suggested that the molecule may act as an intermediate molecule to influence the transmission of inflammatory signals from PKC to ERK .



5 . SSeCKS is involved in the inflammatory proliferation of astrocytes induced by TNF - 偽 . The extensive phosphorylation of SSeCKS after TNF - 偽 stimulation may be one of the reasons for the proliferation of astrocytes .



6 . PKC - SSeCKS and PI3 - 3 could affect the transmission of the proliferative signals induced by TNF - 偽 . There was no obvious upstream - downstream relationship between them , but they could be drawn to each other , suggesting that the pathway of PKC - SSeCKS and PI3 - 3 signaling might exist in the downstream .

【學(xué)位授予單位】：南通大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R392

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：1880598