本文選題：創(chuàng)傷 + 細胞因子�。� 參考：《第四軍醫(yī)大學》2008年博士論文

【摘要】： 研究背景: 機械性創(chuàng)傷(Mechanical trauma, MT,如車禍引起的創(chuàng)傷性傷害)在世界上是一個重要的醫(yī)療和社會問題。眾所周知,胸部MT可以直接引起心臟損傷(如心臟挫傷和血管撕裂)。然而,幾個臨床小組報道,即使沒有直接的機械性心血管損害,鈍性胸部MT也可以引起心肌梗死及心臟功能減退。這些結果強烈提示, MT除了即刻對心臟的直接損傷外,還可以引起一種繼發(fā)性心臟傷害,其機制尚不清楚。 越來越多的證據表明,心肌細胞的凋亡可以導致心臟功能不全。MT后即刻給予非選擇性半胱天冬蛋白酶(Caspase)抑制劑,不僅可以阻斷MT引起的心肌細胞凋亡,而且可以減輕MT后的心臟功能不全。這些結果表明MT引起心肌細胞凋亡,繼之可引起MT后的心臟功能不全。然而,MT導致MT后心肌細胞凋亡的病理性介質的來源和作用機制仍不清楚。辨明MT后心臟功能不全的發(fā)病機制,尋找阻止MT后繼發(fā)性心臟損害的治療策略,對于減少所有MT相關的器官損害至關重要。 研究目的: 1、確定MT引起心肌細胞凋亡的病理性介質的來源,源于創(chuàng)傷性心肌細胞(TCs)還是創(chuàng)傷性血漿(TP); 2、找出MT引起心肌細胞凋亡的主要病理性介質; 3、闡明MT通過病理性介質觸發(fā)心肌細胞凋亡的細胞內信號通路,以期搞清病理性介質、細胞凋亡與氧化/硝化應激的關系。 研究方法: 1、制備小鼠非致命性機械性MT模型。麻醉小鼠后,將其置于Noble-Collip鼓(直徑12英寸),以40 rpm的轉速,旋轉200圈,造成小鼠非致命性MT傷害。 2、為了確定MT后引起心肌細胞凋亡的病理性介質來源于TCs還是TP,分別分離MT組小鼠心肌細胞(TCs)和對照組小鼠心肌細胞(NCs),并分別用含有10%的TP (從MT后1.5 h不同小鼠得到)或正常小鼠血漿(NP)的培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h。 3、為了辨明MT后觸發(fā)心肌細胞凋亡的病理性介質,分離MT小鼠心肌細胞,并分別與下列因子一起培養(yǎng)12 h:1) NP; 2) TP; 3)干擾素(IFN- )、白細胞介素1 (IL-1 )和腫瘤壞死因子α(TNF- )的混合物; 4)分別填加細胞因子混合物中的單一成分;5) TP和抗TNF-抗體; 6) TNF-基因敲除鼠的TP。 4、為了闡明氧化/硝化應激在MT觸發(fā)的心肌細胞凋亡中的作用,分離MT小鼠心肌細胞,分別給予下列之一處理并培養(yǎng)細胞12 h:1) NP; 2) TP; 3) TP和1400W (一種高度選擇性iNOS抑制劑); 4) TP和apocynin (一種NADPH氧化酶抑制劑);或5) TP和FP15 (一種ONOO-分解催化劑)。 5、給予野生型小鼠MT處理后,在體分別給予溶劑、etanercept(一種TNF-拮抗劑)、1400W、apocynin和FP15 ;給予TNF-基因敲除(TNFα-/-)鼠MT處理,不做任何其他處理。將小鼠于MT 12 h后處死。 6、使用相應酶聯免疫吸附法(ELISA)分析試劑盒測定血漿IFN-、IL-1和TNF-濃度。 7、通過檢測caspase-3活性、ELISA法測定核小體或末端脫氧核苷酸轉移酶介導的末端標記術(TUNEL)染色確定心肌細胞的凋亡情況。 8、使用光澤精加強發(fā)光法檢測心肌。O2-的產生量。 9、使用ELISA法檢測心肌細胞硝基酪氨酸(一種在體ONOO-印跡)的含量。 10、使用蛋白質印跡(Western blot)法檢測心肌gp91phox(NADPH氧化酶的一種主要成分)和iNOS含量。 11、使用化學發(fā)光NO探測儀檢測NOX (NO及其代謝產物NO2和NO3的統(tǒng)稱)含量。 研究結果: 1、將TP加到TCs培養(yǎng)液中,引起caspase-3活性的升高(NC+NP組的 2.18±0.24倍, P 0.01, n=9)。而將TCs與NP一起培養(yǎng),未觀察到caspase-3活性顯著性改變(NC+NP組的1.13±0.09倍,P0.05, n=10)。然而,將TP加到NCs培養(yǎng)液中,觀察到caspase-3活性的升高(NC+NP組的1.88±0.18倍,P 0.01, n=9)。這一結果證實,MT引起心肌細胞凋亡的病理性介質存在于TP,而非TCs自身及NP中。 2、雖然MT后,血漿中不同的細胞因子表現出不同的時間曲線的變化,但與對照組比較,創(chuàng)傷動物IL-1、IFN-、和TNF-的血漿水平均顯著性升高(2.19±0.16 vs. 1.11±0.02 pg/mg蛋白, 1.22±0.14 vs. 0.68±0.02 pg/mg蛋白, 0.48±0.02 vs. 0.19±0.01 pg/mg蛋白, P 0.01, n=7-9)。值得注意的是,所有這三個細胞因子達到高峰的時間均早于文獻所述的MT后心肌細胞凋亡發(fā)生的時間點,即在或早于MT后1.5h。 3、將NP和細胞因子混合物與TCs一起培養(yǎng),導致caspase-3活性的升高(NP組的1.71±0.18倍, P 0.01, n=9),升高程度與使用TP處理心肌細胞所觀察到的相似,提示這些細胞因子在TP引起的心肌細胞凋亡中發(fā)揮作用。 4、與NP組比較,單獨填加IFN-或IL-1 ,對caspase-3活性無明顯影響(NP組的0.88±0.15和1.11±0.12倍, P 0.05, n=7-9)。然而,以細胞因子混合物中的使用濃度,單獨填加TNF-顯著性增加了caspase-3活性(NP組的1.64±0.14倍, P 0.01, n=9),提示TNF-是細胞因子混合物中引起心肌細胞凋亡的細胞因子。 5、使用抗TNF-抗體中和TNF- ,幾乎完全阻斷了TP引起的心肌細胞caspase-3的激活(1.13±0.17 vs. 1.88±0.18 NP組的倍數,P 0.01, n=7)。與野生型小鼠TP比較,填加TNF- / 小鼠的TP不能引起顯著性caspase-3的激活(1.10±0.19 vs. 1.88±0.18 NP組的倍數,P 0.01, n=9)。這些結果證明存在于TP中的TNF-是TP引起心肌細胞凋亡首要因素。 6、與NP組比較,使用TP處理心肌細胞,iNOS和gp91phox蛋白表達顯著性上調(NP組的2.44±0.42倍和NP組的1.63±0.18倍,P 0.01, n=7-9),NO和。O2-產生顯著性增多(NP組的2.37±0.31倍和NP組的1.54±0.17倍,P 0.01, n=7-9),ONOO-的產生也顯著性增加(8.02±1.23 vs. 1.87±0.25 nmol/g蛋白, P 0.01, n=7-9)。 更重要的是,使用抗TNF-抗體中和TNF-幾乎完全阻斷了TP引起的氧化/硝化應激,與溶劑組相比,iNOS和gp91phox蛋白的顯著性表達被抑制(1.34±0.32 vs. 2.44±0.42 NP組的倍數, 1.15±0.10 vs. 1.63±0.18 NP組的倍數,P 0.01, n=7-9),NO和。O2-產生明顯減少(1.32±0.12 vs. 2.37±0.30 NP組的倍數, 1.11±0.09 vs. 1.54±0.17 NP組的倍數,P 0.01, n=7-9),ONOO-的產生也顯著性減少(2.77±0.72 vs. 8.02±1.23 nmol/g蛋白,P 0.01, n=7-9)。這些結果提供了明確的證據,即存在于TP中的TNF-是引起TCs顯著氧化/硝化應激的首要因素。 7、與TP組比較,使用1400W顯著性減少了置于TP的心肌細胞的NO產生量(1.04±0.13 vs 2.26±0.11 NP組的倍數, P 0.01, n=10),而未影響。O2-的產生量(1.42±0.07 vs. 1.62±0.15 NP組的倍數, P 0.05, n=10)。相反,使用apocynin顯著性減少了。O2-的產生量(1.04±0.05 vs.1.62±0.15 NP組的倍數, P 0.01, n=10),而未影響NO的產生量(2.20±0.19 vs. 2.26±0.11 NP組的倍數, P 0.05, n=10)。使用FP15既未影響NO(2.16±0.18 vs.2.26±0.11 NP組的倍數, P 0.05, n=9),也未影響。O2-的產生量(1.40±0.06 vs.1.62±0.15 NP組的倍數, P 0.05, n=9)。然而,所有三種處理均顯著性減少了ONOO-的產生量(2.61±0.35, 3.06±0.55, 1.55±0.33 vs. 8.09±1.28 nmol/g蛋白, P 0.01, n=11),并且減少了TP引起的caspase-3激活(1.24±0.16, 1.05±0.10, 1.01±0.14 vs. 1.91±0.14 NP組的倍數, P 0.01, n=10)。這些結果表明TNF-觸發(fā)的氧化/硝基化應激在TP引起的心肌細胞凋亡中發(fā)揮著極重要的作用。 8、在體實驗,與對照組比較,MT導致野生型小鼠顯著性心肌細胞凋亡,表現為TUNEL陽性細胞增多(8.37±0.57 vs. 0.32±0.09% ,P 0.01, n=10)和caspase-3活性升高(是對照組2.9±0.2倍, P 0.01, n=10)。使用etanercept明顯減少了MT后心肌細胞TUNEL陽性染色率( 1.2±0.14% vs. 8.37±0.57%, P 0.01,n=10)和降低caspase-3活性(1.5±0.45 vs. 2.9±0.2對照組的倍數, P 0.01, n=10)。給人留下深刻印象的是,與野生型MT小鼠比較,在TNF-α基因敲除MT小鼠,幾乎無TUNEL陽性細胞(0.8±0.19% vs. 8.37±0.57%, P 0.01 , n=10)和caspase-3激活(1.4±0.16 vs. 2.9±0.2對照組的倍數,P 0.01, n=10)。 9、與對照組比較,野生型小鼠MT處理后,iNOS (29,610±5,093 vs. 1,938±717 AU , P 0.01 , n=10)和gp91phox (104,317±4,361 vs. 10,619±1,522 AU , P 0.01,n=10)的蛋白表達上調,NO ( 9.9±0.7 vs. 7.1±0.4μmol/g蛋白, P 0.01,n=10)和。O2(-273±13.9 vs. 153±8.3 RLU/mg組織, P 0.01, n=10)產生增加,并且蛋白質硝基化明顯增加(2.86±0.09 vs. 1.67±0.05 nmol/g蛋白, P 0.01, n=10)。 然而,與溶劑組比較,在體使用etanercept或TNF-基因敲除處理,降低iNOS蛋白表達(3,380±1,053,2,512±1,154 vs. 29,610±5,093 AU, P 0.01 , n=10)和NO的產生量(7.04±0.56,7.44±0.32 vs. 9.9±0.7μmol/g蛋白, P 0.01, n=10),減少gp91phox蛋白表達(26,478±4,361, 6861±2,239 vs. 104,317±4,361 AU, P 0.01 , n=10)和。O2-的產生(163.1±12.70, 146.1±22.18 vs. 273.2±14.93 RLU/mg組織, P 0.01, n=10),并且減少了蛋白質硝基化(2.09±0.12, 1.54±0.19 vs. 2.86±0.08 nmol/g蛋白, P 0.01 , n=10)。10、在體實驗,與溶劑組比較,使用1400W/apocynin阻斷iNOS/NADPH氧化酶的活性,或使用FP15增加ONOO-的分解,明顯地減少了TUNEL染色數(2.50±0.49、1.51±0.28和1.62±0.12% vs. 8.23±0.48% P 0.01 , n=9-11)和caspase-3的激活(1.63±0.14、1.29±0.09和1.05±0.10 vs. 2.05±0.15空白對照組的倍數, P 0.05或P 0.01 , n=9-11),顯示出MT后心肌細胞的凋亡減少。 研究結論: 1.本研究首次揭示觸發(fā)MT心肌細胞凋亡的病理性介質存在于TP,而非TCs自身; 2.本研究首次證實TP中過多產生的TNF- ,是非致命性MT引起心肌細胞凋亡最主要的病理性介質; 3.本研究首次闡明MT后經TNF-觸發(fā)、通過心肌細胞iNOS和NADPH氧化酶依賴和ONOO-介導的信號通路導致心肌細胞凋亡。 該研究為從分子水平闡明MT誘發(fā)心肌細胞凋亡的機制提供了實驗依據,為臨床防治MT后心肌細胞凋亡提供了新的治療策略。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R641;R363

【引證文獻】

相關博士學位論文 前1條

1 戴文娟;機械性創(chuàng)傷誘發(fā)大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞凋亡機制的研究[D];山西醫(yī)科大學;2011年

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本文編號：1877429