本文選題：雪旺細胞 + 預(yù)變性　； 參考：《復(fù)旦大學》2010年博士論文

【摘要】： 引言：組織工程為周圍神經(jīng)缺損的修復(fù)提供了新的方法,填充了雪旺細胞的可吸收人工神經(jīng)導管有望在將來替代自體神經(jīng)移植應(yīng)用于臨床。通過“激活液”(專利申請中)外源性刺激獲得的激活態(tài)雪旺細胞,在增殖能力和分泌活性都明顯超過正常的雪旺細胞,而且促進神經(jīng)再生的效果也明顯增強。體外培養(yǎng)、擴增的激活態(tài)雪旺細胞應(yīng)用于臨床的一個必要前提是安全可靠,無致癌性、致畸性。本研究的目的是聯(lián)合體內(nèi)、體外多個實驗,檢測激活態(tài)雪旺細胞是否安全,有無應(yīng)用于臨床的可能。本研究共分為4個部分： 目的：通過橫向比較,探索適合臨床應(yīng)用的成年雪旺細胞培養(yǎng)技術(shù)。 方法：成年SD大鼠,分4組,每組10只,從雙側(cè)坐骨神經(jīng)取材培養(yǎng)雪旺細胞。A組采用體內(nèi)預(yù)變性法+快速酶消化法；B組采用體內(nèi)預(yù)變性法+慢速酶消化法；C組采用體外預(yù)變性法+快速酶消化法；D組采用體外預(yù)變性法+慢速酶消化法。細胞傳代使用冷噴射傳代法和胰酶消化傳代法。比較(1)體內(nèi)、體外預(yù)變性增加取材神經(jīng)中雪旺細胞的數(shù)目有無差別；(2)快速、慢速酶消化法從神經(jīng)中獲取雪旺細胞的效率；(3)冷噴射傳代法和胰酶消化傳代法的效率。篩選使動物痛苦小、而雪旺細胞數(shù)量多、純度高等最適合臨床應(yīng)用的方法。 結(jié)果：體外預(yù)變性和體內(nèi)預(yù)變性都能明顯增加取材神經(jīng)中的雪旺細胞數(shù)目,無統(tǒng)計學差異,但體外預(yù)變性減輕了患者的痛苦。快速酶消化法和慢速酶消化法在培養(yǎng)1周時獲得的雪旺細胞數(shù)目相似,無統(tǒng)計學差異。冷噴射傳代法兼有純化雪旺細胞的作用,會損失一定數(shù)量的雪旺細胞,對操作者技術(shù)要求高；胰酶消化傳代法沒有純化的作用,對操作者技術(shù)要求低。 結(jié)論：體外預(yù)變性減輕患者痛苦,更適合臨床應(yīng)用；快速、慢速酶消化法效果無明顯差異,均可考慮應(yīng)用；冷噴射傳代法可以和胰酶消化傳代法有機結(jié)合使用,前者在雪旺細胞純度較低時應(yīng)用,后者在雪旺細胞純度較高時應(yīng)用。 目的：體外檢測激活態(tài)雪旺細胞的生物學特性,與良性、惡性細胞對比,分析其是否有惡性細胞的特點。 方法：從成年大鼠坐骨神經(jīng)中分離并體外培養(yǎng)激活態(tài)雪旺細胞,通過對細胞形態(tài)的連續(xù)觀察、生長方式的變化、免疫學標志物鑒定、增殖率和純度檢測、遷移能力和侵襲能力檢測、染色體核型分析,及全基因組表達譜基因芯片、細胞因子抗體芯片檢測,對激活態(tài)雪旺細胞的生物學特性進行綜合評估。 結(jié)果：激活態(tài)雪旺細胞在體外培養(yǎng)形態(tài)均一、無異質(zhì)性變化。增殖能力增加,受密度抑制影響減小。連續(xù)傳代不丟失S100、P75LNGFR、GFAP等免疫學標識物,遷移能力、侵襲能力略有增加,但明顯弱于惡性細胞。染色體仍為2倍體。基因和蛋白表達存在動態(tài)平衡,第2、3代總體表達最高。 結(jié)論：從成年大鼠周圍神經(jīng)分離并體外培養(yǎng)獲得的激活態(tài)雪旺細胞,基本不具備惡性細胞的生物學特性。 目的：模擬臨床應(yīng)用,探索激活態(tài)雪旺細胞的體內(nèi)變化過程,是否會形成腫瘤。 方法：從成年大鼠雙側(cè)坐骨神經(jīng)培養(yǎng)足量的激活態(tài)雪旺細胞,移植到自體腋窩下,與良性、惡性細胞移植對比。50只成年大鼠分三組：A組：激活態(tài)雪旺細胞,自體移植細胞數(shù)目1×107個,大鼠20只；B：正常雪旺細胞,自體移植細胞數(shù)目1×107個,大鼠20只；C組,惡性大鼠膠質(zhì)瘤C6細胞,移植細胞數(shù)目2×106個,大鼠10只。分別在移植細胞后0.5個月、1個月、2個月、4個月、6個月對大鼠腋窩注射細胞處取材,觀察大體標本上是否有細胞團或腫瘤形成,解剖局部及內(nèi)臟觀察有無腫瘤轉(zhuǎn)移灶的形成。將局部的細胞團塊或腫瘤做免疫組織化學鑒定,并查找病理性核分裂相。 結(jié)果：注射惡性細胞的大鼠(C組),均在0.5-1個月長出腫瘤。而激活態(tài)雪旺細胞組(A組)和正常雪旺細胞組(B組)在體內(nèi)不形成腫瘤,體內(nèi)的過程相似,至少可以在腋窩下存活2個月,并表達免疫學標志物。 結(jié)論：激活態(tài)雪旺細胞在體內(nèi)非正常微環(huán)境下至少可以存活2個月,并表達免疫學標志物,不形成腫瘤。 目的：探索激活態(tài)雪旺細胞自體移植是否對后代產(chǎn)生影響。 方法：從成年雌性動物坐骨神經(jīng)培養(yǎng)出足量的激活態(tài)雪旺細胞后自體移植,然后與雄性大鼠同籠喂養(yǎng)3個月。與單純坐骨神經(jīng)切除的動物對比后代的生物學性狀,如懷孕率,新生鼠的活胎數(shù)、死胎數(shù)、體重、體長、尾長的比較,染色體數(shù)目的檢測。新生鼠4周時的發(fā)育、基本行為能力、對傷害的認知等。 結(jié)果：無論是否移植激活態(tài)雪旺細胞,單側(cè)坐骨神經(jīng)切除后的成年雌性大鼠,3個月內(nèi)懷孕率均為40%。實驗組和對照組的新生鼠的活胎數(shù)、死胎數(shù)、體重、體長、尾長無統(tǒng)計學差異,新生鼠發(fā)育狀況、基本行為能力、對傷害的認知等均未見明顯異常。新生鼠的染色體仍為21對。 結(jié)論：激活態(tài)雪旺細胞的自體移植對成年雌性動物的后代的生物學性狀不產(chǎn)生明顯的影響。
[Abstract]:Introduction : Tissue engineering provides a new method for the repair of peripheral nerve defect , which is expected to be used in clinic in the future . The activated Schwann cells obtained by exogenous stimulation of " active liquid " ( patent application ) are promising to be safe , reliable , non - carcinogenic and Teratogenic . The purpose of this study is to test whether activated Schwann cells are safe and reliable in vitro and in vitro .



Objective : To explore the culture technology of adult Schwann cells suitable for clinical application by transverse comparison .



Methods : Adult SD rats were divided into 4 groups , 10 rats in each group and Schwann cells were cultured from bilateral sciatic nerve .
Group B adopts in vivo pre - degeneration method + slow enzyme digestion method ;
Group C was subjected to an in vitro pre - denaturation method and a rapid enzymatic digestion method ;
( 1 ) In vivo , in vitro pre - degeneration increases the number of Schwann cells in the material nerve .
( 2 ) fast and slow enzyme digestion method to obtain the efficiency of Schwann cells from the nerve ;
( 3 ) The efficiency of cold - injection passage method and pancreatic enzyme digestion and passage method . Screening makes animals less painful , while the number of Schwann cells is much , the purity is the most suitable method for clinical application .



Results : In vitro pre - degeneration and in vivo pre - degeneration could significantly increase the number of Schwann cells in the nerve of the material , but the in vitro predenaturation reduced the pain of the patients . The rapid enzyme digestion and the slow enzyme digestion method were similar to the number of Schwann cells obtained at 1 week .
The pancreatic enzyme digestion and subculture method has no purification function and is low in technical requirements of operators .



Conclusion : In vitro predenaturation reduces the pain of patients and is more suitable for clinical application .
There was no significant difference between the quick and slow enzymatic digestion methods , and the application was also considered .
The cold - injection passage method can be used in combination with trypsin digestion and passaging , the former is applied when the purity of Schwann cells is low , and the latter is applied when the purity of Schwann cells is high .



Objective : To study the biological characteristics of activated Schwann cells in vitro , compare with benign and malignant cells , and analyze the characteristics of malignant cells .



Methods : The activated Schwann cells were isolated from the sciatic nerve of adult rats and cultured in vitro . The biological characteristics of activated Schwann cells were assessed by continuous observation of cell morphology , changes of growth pattern , identification of immunological markers , identification of immunological markers , detection of proliferation and purity , chromosome karyotype analysis , whole genome expression profiling gene chip and cytokine antibody chip .



Results : The cultured Schwann cells were cultured in vitro and had no changes of heterogeneity . The proliferation ability was increased and the effect of density inhibition was decreased . The immune markers , such as S100 , P75LNGFR , GFAP and other immunological markers were not lost in the continuous passage .



Conclusion : The activated Schwann cells isolated from peripheral nerve of adult rats and cultured in vitro have no biological characteristics of malignant cells .



Objective : To explore the clinical application of activated Schwann cells in vivo and to explore whether tumors could be formed .



Methods : A sufficient amount of activated Schwann cells were cultured from bilateral sciatic nerve of adult rats , and compared with benign and malignant cells . 50 adult rats were divided into three groups : group A : activated Schwann cells , 1 脳 107 cells in autologous transplantation , 20 rats in rats ;
B : normal Schwann cells , the number of autologous transplantation cells was 1 脳 107 , the rats were 20 rats ;
Group C , C6 cells of malignant rat glioma , 2 脳 106 cells in transplanted cells , 10 rats in rats , 0.5 months , 1 month , 2 months , 4 months and 6 months after transplantation of cells .



Results : In the rats ( group C ) injected with malignant cells , the tumor was isolated from 0.5 to 1 month . The activated Schwann cells ( group A ) and normal Schwann cells ( group B ) did not form tumors in vivo , and the process was similar in vivo . At least 2 months were viable under the axilla , and the immunological markers were expressed .



Conclusion : Activated Schwann cells can survive at least 2 months in the abnormal microenvironment of the body and express the immunological markers and do not form tumors .



Objective : To explore the effect of autologous transplantation of activated Schwann cells on offspring .



Methods : A sufficient amount of activated Schwann cells were cultured from the sciatic nerve of adult female animals . The biological characters of offspring were compared with those in male rats . The results showed that the biological characters of offspring were compared with those of simple sciatic nerve , such as pregnancy rate , number of live births , number of stillbirths , weight , length of life , tail length , number of chromosomes , development of neonatal rats at 4 weeks , basic behavior , cognition of injury , etc .



Results : No significant difference was found in the number of live births , the number of dead fetuses , the weight , the length of the body , the tail length , the development of neonatal mice , the basic behavior and the cognition of the injury , regardless of whether the activated Schwann cells were transplanted , the number of dead fetuses , the body weight , the body length , the tail length , the development status , the basic behavior and the cognition of the injury .



Conclusion : Autotransplantation of activated Schwann cells has no significant effect on the biological characters of offspring of adult females .

【學位授予單位】：復(fù)旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R329

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本文編號：1873240