發(fā)布時間：2018-05-09 06:37

  本文選題：腸出血性大腸桿菌O157:H7 + 炎癥��； 參考：《第三軍醫(yī)大學》2010年博士論文

【摘要】： 腸出血性大腸桿菌(enterohermorrhangic E. coli, EHEC) O157:H7(EHEC O157)是一種重要的人畜共患傳染病病原,其感染已成為全球性的公共衛(wèi)生問題。自1982年該菌首次被確認為嚴重致病菌以來,全球很多國家和地區(qū)包括中國都多次爆發(fā)流行。EHEC O157感染宿主可導致腹瀉、出血性腸炎、溶血尿毒綜合癥等疾病和嚴重并發(fā)癥。由于抗生素治療可加劇感染病情的危險,目前尚無有效的預防和控制措施。EHEC O157菌培養(yǎng)容易、感染力強、傳播途徑多樣,使其極有可能作為未來軍事斗爭的細菌武器和生物恐怖戰(zhàn)劑,O157菌的烈性致病因子還有可能用于基因武器的構建。美國疾病控制中心已將其列為B類生物恐怖病原體嚴加防范。因此,無論從公共衛(wèi)生還是生物反恐的需要出發(fā),加強其防控研究具有重大的戰(zhàn)略意義。 然而,細菌的致病機制不明確造成了目前EHEC O157感染的治療和預防困境,深入、闡明其致病機制,對有針對性地開發(fā)治療的創(chuàng)新藥物、設計治療方案、研制有效的疫苗、制定預防控制措施具有重要的理論指導作用。 研究表明EHEC O157粘附于宿主腸上皮細胞、引起腸道感染部位劇烈炎癥反應和粘附與擦拭(attaching and effacing, A/E)損傷是EHEC O157感染性疾病的關鍵。EHEC O157通過表面抗原和炎癥刺激因子(OmpA、intimin等)的作用,誘導腸道感染部位劇烈炎癥反應,導致電解質平衡紊亂;同時細菌緊密粘附于腸上皮細胞,通過一系列信號轉導蛋白的相互作用(intimin-Tir, Tir-Cortactin, TCCP-N-WASP等),引起粘附部位肌動蛋白的聚集,導致腸微絨毛破壞、刷狀元受損等腸上皮細胞特征性病例改變,細胞屏障功能破壞,進而引發(fā)感染性疾病。 本研究以EHEC O157粘附于宿主腸上皮細胞、引起腸道感染部位劇烈炎癥反應和介導A/E損傷過程中關鍵蛋白質OmpA、intimin、Tir (translocated intimin receptor)、Cortactin、TCCP (Tir coupled cytosketon protein )、N-WASP (Neural Wiskott-Aldrich syndrome protein)為研究對象,通過結構生物學和分子生物學等相關技術和手段,分析了這些重要蛋白質的結構與功能的關系,為闡明EHEC O157的致病機制提供實驗和理論依據。同時,基于對intimin、EspA和Stx結構生物學和免疫學研究結果,開發(fā)新型疫苗免疫程序,為EHEC的預防控制提供有效支持。具體研究工作從下4個方面展開。 1)外膜蛋白A(outer membrane protein A. OmpA) C端結構域的晶體結構解析與生化特性分析。OmpA作為細菌外膜蛋白,除了參與細菌多個生理過程,還能介導細菌與宿主細胞的粘附和細菌感染部位炎癥反應,在細菌致病過程中發(fā)揮重要作用。EHEC O157 OmpA由N端、C端兩個domain組成。N端domain的結構為典型的β-barrel結構,是OmpA的跨膜區(qū),其功能主要是將OmpA錨定于EHEC O157的外膜。OmpA的C端Domain(OmpAC)可能是其發(fā)揮粘附和促進炎癥反應等諸多功能的主要結構域,但其結構和具體功能尚不清楚。 蛋白質的結構是實現(xiàn)的其功能的基礎,解析蛋白質的結構是認識其功能分子機制的重要手段。本研究重組表達、純化了OmpAC蛋白,制備了OmpAC高質量的蛋白質晶體,通過同步輻射光源衍射,收集到分辨率為2.7 (A|。)的高質量衍射數(shù)據,使用分子置換法解析得到了OmpAC的晶體結構,發(fā)現(xiàn)了OmpAC晶體結構中OmpAC的特征性同源二聚體組成方式(domain-swapped dimer)和swapped dimer為基礎的特征性的肽聚糖結合位點,并通過生化特性分證實了OmpAC在溶液中的二聚體寡聚狀態(tài),從分子水平解釋了OmpA發(fā)揮其生理功能和特殊致病功能的特征性結構基礎。 2) Tir IBD結構域二聚化在intimin-Tir復合體交聯(lián)的作用研究. EHEC定植在腸粘膜處并能產生特有的A/E損傷,是一系列信號轉導蛋白相互作用的結果。腸致病性大腸桿菌(Enteropathogenic Escherichia coli, EPEC)與EHEC類似,也能引起宿主細胞A/E損傷的形成。intimin-Tir的相互作用在EHEC和EPEC引起的A/E損傷的信號轉導過程中發(fā)揮關鍵作用。Tir為兩次跨膜蛋白,N、C端位于胞內,其胞外區(qū)(Tir IBD, intimin binding domain)與細菌的外膜蛋白intimin結合,形成intimin-Tir復合體。intiminβ-barrel結構域為二聚體,該結構域的二聚化效應能夠介導intimin-Tir復合體交聯(lián),進而活化下游信號轉導蛋白,引起肌動蛋白的聚集和A/E損傷。文獻報道EPEC Tir IBD為二聚體,課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)EHEC Tir IBD在晶體結構中也是以二聚體形式存在。提示Tir IBD的二聚體在intimin-Tir相互作用過程中發(fā)揮重要作用。 本研究intimin重組表達了EHEC intimin,Tir IBD和EPEC的intimin,Tir IBD蛋白,通過凝膠過濾層析制備了EHEC intimin- Tir IBD復合體、EPEC intimin- Tir IBD復合體蛋白,通過電子顯微鏡技術和單顆粒結構重建技術觀察到了EHEC和EPEC的intimin-Tir IBD可以形成內徑約10nm的“輪胎”樣寡聚復合體,這與intiminβ-barrel介導的intimin十分相似。同時,通過基因工程手段將Tir IBD形成二聚體的關鍵氨基酸TirEHEC 294Q、TirEPEC297Q和突變成W后,發(fā)現(xiàn)EHEC和EPEC Tir IBD突變體二聚化能力消失。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)EHEC EPEC Intimin-Tir突變體的復合體不能在溶液狀態(tài)下形成寡聚體復合體。結果表明,Tir IBD的二聚化在EPEC和EHEC的intimin-Tir相互作用中,具有類似intiminβ-barrel二聚化的功能,介導intimin-Tir復合物的交聯(lián),在肌動蛋白聚集和A/E損傷的信號轉導過程中發(fā)揮重要作用。 3)TirN、Cortactin SH3、TCCP和N-WASP的初步晶體學研究和生化特性分析。EHEC O157定植在腸粘膜處并能產生特有的A/E損傷的信號轉導過程是一個系統(tǒng)的信號轉導過程,除了需要胞膜蛋白intimin-Tir的相互作用,胞內信號分子Tir N端胞內段(TirN)與Cortactin SH3結構域相互作用、TCCP與N-WASP的相互作用在細菌引起肌動蛋白聚集、A/E損傷的過程的信號轉導途徑也發(fā)揮關鍵作用。但是它們相互作用的分子機制還不清楚。 本研究重組表達了TirN、Cortactin-SH3、TCCP和N-WASP蛋白,并開展了這些重組蛋白的初步晶體學研究。取得結果:(1)制備了TirN蛋白和含硒代甲硫氨酸的TirN蛋白的晶體,分別收集到了2.4 (A|。)和2.5(A|。)的高質量衍射數(shù)據,目前正采用多波長反差散射方法解析TirN的晶體結構。(2)通過凝膠過濾層析,化學交聯(lián)分析和動態(tài)光散射分析TirN在溶液狀態(tài)下以二聚體形式存在,為Tir胞外區(qū)二聚化在intimin-Tir復合體交聯(lián)過程中發(fā)揮重要作用提供了實驗依據。(3)重組表達了N-WASP與TCCP相互作用的蛋白N-WASP160,篩選到了N-WASP160蛋白質晶體,但晶體質量較差。晶體優(yōu)化工作正在進行中。(4)通過凝膠過濾層析制備了TCCP與N-WASP復合體蛋白,并對復合體進行了初步晶體生長條件篩選。這些結果為下一步繼續(xù)開展A/E損傷機制研究打下了堅實的基礎。 4)以Intimin、EspA、Stx2B為基礎的EHEC O157基因工程疫苗研究。 從晶體結構證實和前期的免疫學實驗表明,EHEC O157的致病因子EspA、intimin C端300個氨基酸(intimin C300)和Stx2 B亞單位(Stx2B)是較好的免疫原,單獨作為抗原時,具有良好的免疫原性和免疫保護性。課題組前期通過基因工程手段將這EspA、IntiminC300和Stx2B通過linker YAPQDP和GSGGSG連接起來,構建三價重組疫苗(EspA-IntiminC300-Stx2B,EIS),并通過小鼠動物模型發(fā)現(xiàn)該疫苗能夠誘導產生高效價的保護性免疫反應。此外,表達EIS的減毒傷寒沙門菌疫苗口服免疫小鼠能夠刺激其明顯保護性免疫反應。 本研究制備了抗EIS多克隆抗體,通過細胞試驗發(fā)現(xiàn)證實該抗體能夠阻斷EHEC O157引起HeLa的肌動蛋白聚集,為解釋EIS疫苗的保護性機制提供了理論依據。此外,開發(fā)了將EIS減毒傷寒沙門菌疫苗和重組EIS蛋白疫苗相結合的聯(lián)合免疫程序,發(fā)現(xiàn)小鼠經此程序免疫后能夠產生更好的保護性免疫反應。這些結果為EHEC O157的預防控制提供有效實驗和理論支持。
[Abstract]:Enterohermorrhangic E . coli ( EHEC ) 157 : H7 ( EHEC 0157 ) is an important pathogen of human and livestock co - infection . Its infection has become a global public health problem . Since the first confirmation of the bacterium as a serious pathogenic bacterium in 1982 , many countries and regions of the world , including China , have been popular many times .



However , the pathogenic mechanism of bacteria does not clearly cause the treatment and prevention of the current EHEC 0157 infection , in - depth , clarifies its pathogenic mechanism , designs the treatment plan , develops an effective vaccine for the targeted development of the therapy , develops the effective vaccine , and has important theoretical guiding role in the development of prevention control measures .



The results showed that EHEC 0157 was adhered to host intestinal epithelial cells , causing severe inflammatory reaction and adhesion and wiping ( A / E ) injury in intestinal tract infection , which caused severe inflammatory reaction in intestinal tract infection site , which led to the disorder of electrolyte balance , and the interaction of the bacterial closely adhered to intestinal epithelial cells ( intimin - Tir , Tir - Cornun , TCCP - N - WASP ) .



In this study , we studied the relationship between the structure and function of EHEC 0157 in host intestinal epithelial cells , which caused severe inflammatory reaction in intestinal tract infection sites and mediated A / E injury . The relationship between structure and function of these important proteins was analyzed by means of structural biology and molecular biology .



The structure of OmpA is a typical 尾 - barrel structure , which is the transmembrane region of OmpA . The structure of OmpA is a typical 尾 - barrel structure . The C - terminal domain ( OmpAC ) of OmpA may be the main domain in which it exerts adhesion and promotes inflammatory reaction , but its structure and specific function are not clear .



The structure of protein is the basis of its function . The structure of protein is an important means to recognize its functional molecular mechanism . By recombinant expression , OmpAC protein is purified and OmpAC high - quality protein crystal is prepared . By means of synchrotron radiation source diffraction , the resolution is 2.7 ( A ) . In this paper , the crystal structure of OmpAC was obtained by molecular displacement method , and the characteristic peptidoglycan binding sites based on OmpAC were found in OmpAC crystal structure , and the dimer oligopolymerization of OmpAC in solution was confirmed by biochemical characterization . The molecular level was used to explain the characteristic structure of OmpA in its physiological function and special pathogenic function .



2 ) The effect of Tir IBD domain dimerization on the crosslinking of intimin - Tir complex . EHEC瀹氭鍦ㄨ偁綺樿啘澶勫茍鑳戒駭鐢熺壒鏈夌殑A/E鎹熶激,鏄竴緋誨垪淇″彿杞铔嬬櫧鐩鎬簰浣滅敤鐨勭粨鏋，

本文編號：1864971