本文選題：腸出血性大腸桿菌O157:H7 + 炎癥��； 參考：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2010年博士論文

【摘要】： 腸出血性大腸桿菌(enterohermorrhangic E. coli, EHEC) O157:H7(EHEC O157)是一種重要的人畜共患傳染病病原,其感染已成為全球性的公共衛(wèi)生問題。自1982年該菌首次被確認(rèn)為嚴(yán)重致病菌以來,全球很多國家和地區(qū)包括中國都多次爆發(fā)流行。EHEC O157感染宿主可導(dǎo)致腹瀉、出血性腸炎、溶血尿毒綜合癥等疾病和嚴(yán)重并發(fā)癥。由于抗生素治療可加劇感染病情的危險,目前尚無有效的預(yù)防和控制措施。EHEC O157菌培養(yǎng)容易、感染力強、傳播途徑多樣,使其極有可能作為未來軍事斗爭的細(xì)菌武器和生物恐怖戰(zhàn)劑,O157菌的烈性致病因子還有可能用于基因武器的構(gòu)建。美國疾病控制中心已將其列為B類生物恐怖病原體嚴(yán)加防范。因此,無論從公共衛(wèi)生還是生物反恐的需要出發(fā),加強其防控研究具有重大的戰(zhàn)略意義。 然而,細(xì)菌的致病機制不明確造成了目前EHEC O157感染的治療和預(yù)防困境,深入、闡明其致病機制,對有針對性地開發(fā)治療的創(chuàng)新藥物、設(shè)計治療方案、研制有效的疫苗、制定預(yù)防控制措施具有重要的理論指導(dǎo)作用。 研究表明EHEC O157粘附于宿主腸上皮細(xì)胞、引起腸道感染部位劇烈炎癥反應(yīng)和粘附與擦拭(attaching and effacing, A/E)損傷是EHEC O157感染性疾病的關(guān)鍵。EHEC O157通過表面抗原和炎癥刺激因子(OmpA、intimin等)的作用,誘導(dǎo)腸道感染部位劇烈炎癥反應(yīng),導(dǎo)致電解質(zhì)平衡紊亂;同時細(xì)菌緊密粘附于腸上皮細(xì)胞,通過一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的相互作用(intimin-Tir, Tir-Cortactin, TCCP-N-WASP等),引起粘附部位肌動蛋白的聚集,導(dǎo)致腸微絨毛破壞、刷狀元受損等腸上皮細(xì)胞特征性病例改變,細(xì)胞屏障功能破壞,進(jìn)而引發(fā)感染性疾病。 本研究以EHEC O157粘附于宿主腸上皮細(xì)胞、引起腸道感染部位劇烈炎癥反應(yīng)和介導(dǎo)A/E損傷過程中關(guān)鍵蛋白質(zhì)OmpA、intimin、Tir (translocated intimin receptor)、Cortactin、TCCP (Tir coupled cytosketon protein )、N-WASP (Neural Wiskott-Aldrich syndrome protein)為研究對象,通過結(jié)構(gòu)生物學(xué)和分子生物學(xué)等相關(guān)技術(shù)和手段,分析了這些重要蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,為闡明EHEC O157的致病機制提供實驗和理論依據(jù)。同時,基于對intimin、EspA和Stx結(jié)構(gòu)生物學(xué)和免疫學(xué)研究結(jié)果,開發(fā)新型疫苗免疫程序,為EHEC的預(yù)防控制提供有效支持。具體研究工作從下4個方面展開。 1)外膜蛋白A(outer membrane protein A. OmpA) C端結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)解析與生化特性分析。OmpA作為細(xì)菌外膜蛋白,除了參與細(xì)菌多個生理過程,還能介導(dǎo)細(xì)菌與宿主細(xì)胞的粘附和細(xì)菌感染部位炎癥反應(yīng),在細(xì)菌致病過程中發(fā)揮重要作用。EHEC O157 OmpA由N端、C端兩個domain組成。N端domain的結(jié)構(gòu)為典型的β-barrel結(jié)構(gòu),是OmpA的跨膜區(qū),其功能主要是將OmpA錨定于EHEC O157的外膜。OmpA的C端Domain(OmpAC)可能是其發(fā)揮粘附和促進(jìn)炎癥反應(yīng)等諸多功能的主要結(jié)構(gòu)域,但其結(jié)構(gòu)和具體功能尚不清楚。 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)是實現(xiàn)的其功能的基礎(chǔ),解析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)是認(rèn)識其功能分子機制的重要手段。本研究重組表達(dá)、純化了OmpAC蛋白,制備了OmpAC高質(zhì)量的蛋白質(zhì)晶體,通過同步輻射光源衍射,收集到分辨率為2.7 (A|。)的高質(zhì)量衍射數(shù)據(jù),使用分子置換法解析得到了OmpAC的晶體結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)了OmpAC晶體結(jié)構(gòu)中OmpAC的特征性同源二聚體組成方式(domain-swapped dimer)和swapped dimer為基礎(chǔ)的特征性的肽聚糖結(jié)合位點,并通過生化特性分證實了OmpAC在溶液中的二聚體寡聚狀態(tài),從分子水平解釋了OmpA發(fā)揮其生理功能和特殊致病功能的特征性結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。 2) Tir IBD結(jié)構(gòu)域二聚化在intimin-Tir復(fù)合體交聯(lián)的作用研究. EHEC定植在腸粘膜處并能產(chǎn)生特有的A/E損傷,是一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白相互作用的結(jié)果。腸致病性大腸桿菌(Enteropathogenic Escherichia coli, EPEC)與EHEC類似,也能引起宿主細(xì)胞A/E損傷的形成。intimin-Tir的相互作用在EHEC和EPEC引起的A/E損傷的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Tir為兩次跨膜蛋白,N、C端位于胞內(nèi),其胞外區(qū)(Tir IBD, intimin binding domain)與細(xì)菌的外膜蛋白intimin結(jié)合,形成intimin-Tir復(fù)合體。intiminβ-barrel結(jié)構(gòu)域為二聚體,該結(jié)構(gòu)域的二聚化效應(yīng)能夠介導(dǎo)intimin-Tir復(fù)合體交聯(lián),進(jìn)而活化下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白,引起肌動蛋白的聚集和A/E損傷。文獻(xiàn)報道EPEC Tir IBD為二聚體,課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)EHEC Tir IBD在晶體結(jié)構(gòu)中也是以二聚體形式存在。提示Tir IBD的二聚體在intimin-Tir相互作用過程中發(fā)揮重要作用。 本研究intimin重組表達(dá)了EHEC intimin,Tir IBD和EPEC的intimin,Tir IBD蛋白,通過凝膠過濾層析制備了EHEC intimin- Tir IBD復(fù)合體、EPEC intimin- Tir IBD復(fù)合體蛋白,通過電子顯微鏡技術(shù)和單顆粒結(jié)構(gòu)重建技術(shù)觀察到了EHEC和EPEC的intimin-Tir IBD可以形成內(nèi)徑約10nm的“輪胎”樣寡聚復(fù)合體,這與intiminβ-barrel介導(dǎo)的intimin十分相似。同時,通過基因工程手段將Tir IBD形成二聚體的關(guān)鍵氨基酸TirEHEC 294Q、TirEPEC297Q和突變成W后,發(fā)現(xiàn)EHEC和EPEC Tir IBD突變體二聚化能力消失。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)EHEC EPEC Intimin-Tir突變體的復(fù)合體不能在溶液狀態(tài)下形成寡聚體復(fù)合體。結(jié)果表明,Tir IBD的二聚化在EPEC和EHEC的intimin-Tir相互作用中,具有類似intiminβ-barrel二聚化的功能,介導(dǎo)intimin-Tir復(fù)合物的交聯(lián),在肌動蛋白聚集和A/E損傷的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用。 3)TirN、Cortactin SH3、TCCP和N-WASP的初步晶體學(xué)研究和生化特性分析。EHEC O157定植在腸粘膜處并能產(chǎn)生特有的A/E損傷的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程是一個系統(tǒng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程,除了需要胞膜蛋白intimin-Tir的相互作用,胞內(nèi)信號分子Tir N端胞內(nèi)段(TirN)與Cortactin SH3結(jié)構(gòu)域相互作用、TCCP與N-WASP的相互作用在細(xì)菌引起肌動蛋白聚集、A/E損傷的過程的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑也發(fā)揮關(guān)鍵作用。但是它們相互作用的分子機制還不清楚。 本研究重組表達(dá)了TirN、Cortactin-SH3、TCCP和N-WASP蛋白,并開展了這些重組蛋白的初步晶體學(xué)研究。取得結(jié)果:(1)制備了TirN蛋白和含硒代甲硫氨酸的TirN蛋白的晶體,分別收集到了2.4 (A|。)和2.5(A|。)的高質(zhì)量衍射數(shù)據(jù),目前正采用多波長反差散射方法解析TirN的晶體結(jié)構(gòu)。(2)通過凝膠過濾層析,化學(xué)交聯(lián)分析和動態(tài)光散射分析TirN在溶液狀態(tài)下以二聚體形式存在,為Tir胞外區(qū)二聚化在intimin-Tir復(fù)合體交聯(lián)過程中發(fā)揮重要作用提供了實驗依據(jù)。(3)重組表達(dá)了N-WASP與TCCP相互作用的蛋白N-WASP160,篩選到了N-WASP160蛋白質(zhì)晶體,但晶體質(zhì)量較差。晶體優(yōu)化工作正在進(jìn)行中。(4)通過凝膠過濾層析制備了TCCP與N-WASP復(fù)合體蛋白,并對復(fù)合體進(jìn)行了初步晶體生長條件篩選。這些結(jié)果為下一步繼續(xù)開展A/E損傷機制研究打下了堅實的基礎(chǔ)。 4)以Intimin、EspA、Stx2B為基礎(chǔ)的EHEC O157基因工程疫苗研究。 從晶體結(jié)構(gòu)證實和前期的免疫學(xué)實驗表明,EHEC O157的致病因子EspA、intimin C端300個氨基酸(intimin C300)和Stx2 B亞單位(Stx2B)是較好的免疫原,單獨作為抗原時,具有良好的免疫原性和免疫保護(hù)性。課題組前期通過基因工程手段將這EspA、IntiminC300和Stx2B通過linker YAPQDP和GSGGSG連接起來,構(gòu)建三價重組疫苗(EspA-IntiminC300-Stx2B,EIS),并通過小鼠動物模型發(fā)現(xiàn)該疫苗能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生高效價的保護(hù)性免疫反應(yīng)。此外,表達(dá)EIS的減毒傷寒沙門菌疫苗口服免疫小鼠能夠刺激其明顯保護(hù)性免疫反應(yīng)。 本研究制備了抗EIS多克隆抗體,通過細(xì)胞試驗發(fā)現(xiàn)證實該抗體能夠阻斷EHEC O157引起HeLa的肌動蛋白聚集,為解釋EIS疫苗的保護(hù)性機制提供了理論依據(jù)。此外,開發(fā)了將EIS減毒傷寒沙門菌疫苗和重組EIS蛋白疫苗相結(jié)合的聯(lián)合免疫程序,發(fā)現(xiàn)小鼠經(jīng)此程序免疫后能夠產(chǎn)生更好的保護(hù)性免疫反應(yīng)。這些結(jié)果為EHEC O157的預(yù)防控制提供有效實驗和理論支持。
[Abstract]:Enterohermorrhangic E . coli ( EHEC ) 157 : H7 ( EHEC 0157 ) is an important pathogen of human and livestock co - infection . Its infection has become a global public health problem . Since the first confirmation of the bacterium as a serious pathogenic bacterium in 1982 , many countries and regions of the world , including China , have been popular many times .



However , the pathogenic mechanism of bacteria does not clearly cause the treatment and prevention of the current EHEC 0157 infection , in - depth , clarifies its pathogenic mechanism , designs the treatment plan , develops an effective vaccine for the targeted development of the therapy , develops the effective vaccine , and has important theoretical guiding role in the development of prevention control measures .



The results showed that EHEC 0157 was adhered to host intestinal epithelial cells , causing severe inflammatory reaction and adhesion and wiping ( A / E ) injury in intestinal tract infection , which caused severe inflammatory reaction in intestinal tract infection site , which led to the disorder of electrolyte balance , and the interaction of the bacterial closely adhered to intestinal epithelial cells ( intimin - Tir , Tir - Cornun , TCCP - N - WASP ) .



In this study , we studied the relationship between the structure and function of EHEC 0157 in host intestinal epithelial cells , which caused severe inflammatory reaction in intestinal tract infection sites and mediated A / E injury . The relationship between structure and function of these important proteins was analyzed by means of structural biology and molecular biology .



The structure of OmpA is a typical 尾 - barrel structure , which is the transmembrane region of OmpA . The structure of OmpA is a typical 尾 - barrel structure . The C - terminal domain ( OmpAC ) of OmpA may be the main domain in which it exerts adhesion and promotes inflammatory reaction , but its structure and specific function are not clear .



The structure of protein is the basis of its function . The structure of protein is an important means to recognize its functional molecular mechanism . By recombinant expression , OmpAC protein is purified and OmpAC high - quality protein crystal is prepared . By means of synchrotron radiation source diffraction , the resolution is 2.7 ( A ) . In this paper , the crystal structure of OmpAC was obtained by molecular displacement method , and the characteristic peptidoglycan binding sites based on OmpAC were found in OmpAC crystal structure , and the dimer oligopolymerization of OmpAC in solution was confirmed by biochemical characterization . The molecular level was used to explain the characteristic structure of OmpA in its physiological function and special pathogenic function .



2 ) The effect of Tir IBD domain dimerization on the crosslinking of intimin - Tir complex . EHEC瀹氭鍦ㄨ偁綺樿啘澶勫茍鑳戒駭鐢熺壒鏈夌殑A/E鎹熶激,鏄竴緋誨垪淇″彿杞铔嬬櫧鐩鎬簰浣滅敤鐨勭粨鏋，

本文編號：1864971