本文選題：肺炎鏈球菌 + licC基因�。� 參考：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2010年碩士論文

【摘要】： 肺炎鏈球菌普遍定植于呼吸道,是人類重要的侵襲性病原菌之一,是社區(qū)獲得性肺炎、中耳炎、腦膜炎、菌血癥、鼻竇炎的主要病原菌,其引起的腦膜炎和菌血癥死亡率高。肺炎鏈球菌主要感染2歲以下幼兒及65歲以上老年人,是全球范圍內(nèi)導(dǎo)致兒童死亡的最重要原因之一。另一方面,自上世紀(jì)60年代中期發(fā)現(xiàn)第一株對(duì)青霉素耐藥的肺炎鏈球菌(PRSP)以來(lái),耐藥狀況發(fā)展迅速,分離率明顯上升,在一些國(guó)家和地區(qū),PRSP已高達(dá)40%～50%。并且,多重耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重,PRSP菌株中,有60%～90%同時(shí)對(duì)氯霉素、克林霉素、磺胺甲基異惡唑、紅霉素、四環(huán)素耐藥。隨著近年來(lái)肺炎鏈球菌耐藥性的不斷增強(qiáng)和有效疫苗的缺乏,新的治療靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)變得越來(lái)越重要,肺炎鏈球菌致病相關(guān)基因愈來(lái)愈受到關(guān)注和重視。 我們?cè)谇捌谘芯恐胁捎眯盘?hào)標(biāo)簽突變技術(shù)(Signature tagged mutagenesis, STM)構(gòu)建了肺炎鏈球菌突變體文庫(kù),篩選到了一個(gè)新的肺炎鏈球菌致病相關(guān)基因licC (CTP:Phosphocholine Cytidylyltransferase)。它是核苷轉(zhuǎn)移酶家族的獨(dú)特成員,編碼磷酸化膽堿胞苷酰轉(zhuǎn)移酶(CTP:phosphocholine cytidylyltransferase,CCT),負(fù)責(zé)生成二磷酸胞嘧啶膽堿(CDP-Cho),是合成磷酸化膽堿(phosphocholine,PCho)的關(guān)鍵酶之一。研究表明,膽堿代謝在肺炎鏈球菌的細(xì)胞分裂、轉(zhuǎn)化、自溶和致病過(guò)程中具有重要作用,PCho不僅本身就是一個(gè)毒力因子,與其結(jié)合在一起的膽堿結(jié)合蛋白更是肺炎鏈球菌黏附和侵襲必不可少的因素。前期實(shí)驗(yàn)中,我們建立了STM插入突變株,插入點(diǎn)位于licC 3’端78bp處,實(shí)驗(yàn)表明,licC基因的突變可使細(xì)菌毒力顯著減弱、生長(zhǎng)嚴(yán)重受抑,并且與多種毒力因子相關(guān)聯(lián)。同時(shí),licC在肺炎鏈球菌中極為保守,與其他真核和原核細(xì)胞相應(yīng)基因缺乏同源性,是一個(gè)理想的藥物靶點(diǎn),在研究新型抗肺炎鏈球菌藥物方面具有良好前景。 在此基礎(chǔ)上,本研究將進(jìn)一步探討STM插入突變株在生物學(xué)特性和毒力方面發(fā)生變化的原因,尋找LicC的重要功能位點(diǎn),研究該基因在肺炎鏈球菌生長(zhǎng)和致病過(guò)程中的作用,并構(gòu)建licC低表達(dá)菌株,為針對(duì)licC的藥物篩選打下基礎(chǔ)。 本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了重組質(zhì)粒pQE80-licC、pQE80-?licC,包含了licC的全序列和licC截短體(?licC)。其中?licC為3’端78bp缺失的licC序列,與STM插入突變株中l(wèi)icC的缺失部分一致�？扇苄苑治霰砻�,E.coli BL21成功表達(dá)目的蛋白, LicC及?LicC均在上清中有表達(dá),并通過(guò)親和層析獲得純化蛋白。實(shí)驗(yàn)中,自行建立了生物發(fā)光技術(shù),用以測(cè)定表達(dá)蛋白的酶活性,結(jié)果顯示?licC的活性僅相當(dāng)于全序列蛋白的6%,證實(shí)缺失區(qū)域與酶活性密切相關(guān)。由于缺失部分包含了與Mg2+結(jié)合的Glu216,我們推測(cè)活性減低與缺失了該谷氨酸關(guān)系密切;從而解釋了STM突變株生長(zhǎng)減慢、毒性減低的原因,證實(shí)缺失區(qū)域是LicC重要的功能位點(diǎn)之一。 構(gòu)建licC缺失突變株并進(jìn)行一系列相關(guān)功能試驗(yàn)是研究LicC在肺炎鏈球菌致病過(guò)程中作用的重要方法。我們擬采用構(gòu)建多個(gè)突變子(上游同源臂+篩選標(biāo)記序列+下游同源臂)轉(zhuǎn)化肺炎鏈球菌、通過(guò)同源重組的方法獲得licC缺失突變株。但是,即使構(gòu)建的6個(gè)突變子覆蓋了licC不同長(zhǎng)度的缺失基因,不同長(zhǎng)度的上、下游同源臂及不同的抗生素篩選標(biāo)記基因;同時(shí),設(shè)置肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化陽(yáng)性對(duì)照對(duì)轉(zhuǎn)化過(guò)程進(jìn)行質(zhì)量控制的情況下,仍然未能獲得licC缺失突變株。即使得到了一株下游同源臂發(fā)生同源重組的突變株,但該突變株中,licC仍是完整基因(licC的缺失突變由上游同源臂引發(fā));而同源重組構(gòu)建策略已證明是構(gòu)建肺炎鏈球菌突變株簡(jiǎn)便、高效、成熟的方案,在大量研究中均得到運(yùn)用;于是,結(jié)合文獻(xiàn),我們認(rèn)為licC是肺炎鏈球菌的必需基因,同樣證實(shí)了將licC作為藥物靶點(diǎn)的可行性。 在構(gòu)建licC缺失突變株過(guò)程中,仍然獲得了一株下游同源臂發(fā)生同源重組而將抗生素篩選標(biāo)記序列整合入基因組的突變株。我們推測(cè),出現(xiàn)該突變株的原因可能有:①下游同源臂發(fā)生預(yù)期的同源重組,導(dǎo)致突變子的一端嵌入基因組。②licC是必需基因,難以由缺失的licC序列的上游同源臂替換licC全序列而發(fā)生預(yù)期的同源重組。③抗生素壓力下,將抗生素篩選標(biāo)記序列整合入基因組。經(jīng)測(cè)序證實(shí),雖然licC未發(fā)生缺失突變,但licC的下游基因dprA發(fā)生了插入突變。相關(guān)實(shí)驗(yàn)證實(shí)該突變株黏附能力下降(僅相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)株的約30%)、疏水性發(fā)生改變、約100KD的膽堿結(jié)合蛋白缺失,從而首次證實(shí)dprA與肺炎鏈球菌毒力相關(guān),具體機(jī)制仍有待研究。由于dprA是肺炎鏈球菌自然轉(zhuǎn)化的必需基因,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為將肺炎鏈球菌的自然轉(zhuǎn)化和毒力進(jìn)行聯(lián)合研究打開了思路。 反義RNA(Antisense RNA,ASRNA)作為有效抑制目的基因表達(dá)的手段已為大家所公認(rèn)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)該方法構(gòu)建了LicC低表達(dá)株。實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)了3條反義RNA,分別代表了不同的長(zhǎng)度,即licC基因5’端321bp、506bp、708bp片段,利于從中挑選出抑制效果較好的ASRNA。以抗LicC抗體為一抗的western blot表明,3條ASRNA均有一定程度的抑制作用,成功構(gòu)建了licC低表達(dá)株。該低表達(dá)菌株的獲得彌補(bǔ)了未能建立licC缺失突變株的缺憾,對(duì)licC在生物學(xué)特性、致病力等方面的研究具有重要意義,并且為針對(duì)LicC的全細(xì)胞藥物篩選奠定了基礎(chǔ)。 綜上所述,本研究成功闡釋了STM插入突變株在生長(zhǎng)和毒力方面發(fā)生變化的原因,證實(shí)了3’端78bp是licC的重要功能位點(diǎn);針對(duì)licC進(jìn)行同源重組構(gòu)建突變株的失敗反向證實(shí)了licC是肺炎鏈球菌的必需基因,為針對(duì)LicC的新型藥物篩選打下了理論基礎(chǔ);并構(gòu)建了licC低表達(dá)菌株,對(duì)licC的功能研究和藥物篩選具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)還意外地獲得了dprA突變株,并首次證實(shí)了dprA在肺炎鏈球菌毒力中的作用,提示抑制單個(gè)基因就可能達(dá)到同時(shí)抑制肺炎鏈球菌自然轉(zhuǎn)化和毒力的效應(yīng)。
[Abstract]:Streptococcus pneumoniae is widely cultivated in respiratory tract . It is one of the most important invasive pathogenic bacteria in the community . It is one of the most important pathogens of community acquired pneumonia , otitis media , meningitis , bacteraemia and sinusitis .


In the preliminary study , we constructed a library of Streptococcus pneumoniae mutants by using signal tag mutation technique ( STM ) , and screened a new gene licC ( CTP : choline Cytidylyltransferase ) associated with Streptococcus pneumoniae . It is a unique member of nucleoside transferase family , encoding phosphorylcholine cytidylyltransferase ( CCT ) , which is one of the key enzymes in the synthesis of phosphocholine ( CDP - Cho ) .


On the basis of this , this study will further explore the cause of the changes in the biological characteristics and virulence of STM inserted mutant strain , look for the important functional site of LicC , investigate the role of the gene in the growth and pathogenic process of Streptococcus pneumoniae , and construct licC low expression strain , which lays the foundation for drug screening against licC .


In this experiment , we constructed the recombinant plasmid pQE80 - licC , pQE80 - ? licC , which contains the whole sequence of licC and licC truncated body ( ? licC ) . The results show that the activity of licC is only 6 % of the total sequence protein . The results show that the activity of licC is only 6 % of the total sequence protein . The results show that the activity of licC is only equivalent to 6 % of the whole sequence protein .


A series of related functional tests were carried out to construct licC deletion mutant strain and a series of related functional tests were carried out to investigate the role of LicC in the pathogenesis of Streptococcus pneumoniae .


In the process of constructing licC deletion mutant , the homologous recombination of the downstream homologous arm was still obtained , and the sequence of antibiotic selection marker was integrated into the genome .


The expression of antisense RNA ( ASRNA ) as an effective way to inhibit the expression of target genes has been widely recognized . Three antisense RNAs were constructed by this method . Three antisense RNAs were designed to represent different lengths , i.e . 5 ' end 321bp , 506bp , 708bp fragment of licC gene .


In conclusion , this study successfully illustrates the cause of changes in the growth and virulence of the insertion mutant of STM , and confirms that the 3 ' - end 78bp is an important functional site of licC . It has been proved that licC is the essential gene of Streptococcus pneumoniae , which lays a theoretical foundation for the new drug screening of LicC . It has also been shown that the role of the mutant A in the virulence of Streptococcus pneumoniae has been confirmed for the first time . It is suggested that the inhibition of the single gene may achieve the effect of inhibiting the natural transformation and virulence of Streptococcus pneumoniae .

【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R378

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本文編號(hào)：1862045