本文選題：臍帶 + 間充質(zhì)干細(xì)胞��； 參考：《天津醫(yī)科大學(xué)》2010年碩士論文

【摘要】： 目的探討人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)的方法,研究氯化鈷(CoCl2)缺氧處理對(duì)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響,探討CoCl2模擬缺氧預(yù)處理對(duì)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞中堿性成纖維生長因子(bFGF)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)基因表達(dá)及蛋白分泌的影響。 方法無菌條件下收集剖宮產(chǎn)新生兒臍帶,利用PBS沖洗臍動(dòng)脈、靜脈,將血液沖洗干凈,將其剪碎至1mm3后,加入0.1%Ⅳ型膠原酶,置37℃恒溫振蕩儀振蕩消化60min,加入0.25%胰酶,再次恒溫振蕩30min,PBS稀釋后濾網(wǎng)過濾,收集細(xì)胞濾液,離心去除上清液,PBS洗滌2遍,DMEM/F12重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為5×106/ml,接種于75cm培養(yǎng)瓶,置37。C、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),48h后換液,去除懸浮細(xì)胞。以后每7d換液1次,細(xì)胞生長至80%～90%融合時(shí),用0.25%胰蛋白酶消化,按1：3傳代,應(yīng)用倒置相差顯微鏡隔日觀察細(xì)胞生長形態(tài),取第3代的UC-MSCs流式細(xì)胞儀檢測其表面標(biāo)志(CD34、CD45、CD90、CD105、CD29及CD49)；MTT法檢測不同濃度(0、50、100、150、200、250μmol/L) CoCl2對(duì)UC-MSCs活力及增殖的影響；運(yùn)用含150μmol/L的CoCl2培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞72 h,用流式細(xì)胞儀檢測缺氧對(duì)UC-MSCs表面標(biāo)志物(CD34、CD45、CD90、CD105、CD29及CD49)；依據(jù)CoCl2的濃度(0、50、100μmol/L及150μmol/L)將UC-MSCs分為4個(gè)組,即對(duì)照組、低、中、高CoCl2組,每個(gè)組處理24 h、48 h和72 h。用SYBRGREN熒光定量RT-PCR檢測bFGF、VEGF mRNA的表達(dá),用ELISA法檢測bFGF和VEGF蛋白的表達(dá)。 結(jié)果利用膠原酶及胰酶兩步消化法能充分消化臍帶,易于獲得間充質(zhì)干細(xì)胞,倒置顯微鏡觀察顯示：培養(yǎng)24h后,可見散在的細(xì)胞貼壁,貼壁細(xì)胞呈長梭形或不規(guī)則形；培養(yǎng)4～5d后,貼壁細(xì)胞明顯增多,胞體中央膨大,細(xì)胞呈長梭形或不規(guī)則形；培養(yǎng)8～9d后,細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底面,呈漩渦狀或輻射狀生長,細(xì)胞傳代后,觀察細(xì)胞形態(tài)仍為長梭形,不規(guī)則形,呈漩渦樣生長；經(jīng)含150μmol/L CoCl2的培養(yǎng)液缺氧預(yù)處理,UC-MSCs仍高表達(dá)CD90、CD29、CD49及CD105,低表達(dá)CD34和CD45,倒置相差顯微鏡觀察,細(xì)胞形態(tài)仍為長梭形或不規(guī)則形；未加CoCl2組(對(duì)照組)細(xì)胞生長曲線呈“S”形。經(jīng)CoCl2處理后,各組細(xì)胞生長曲線呈不太明顯的“S”形,對(duì)數(shù)生長期提前,缺氧的前1～3d細(xì)胞增殖速度加快,對(duì)數(shù)期比對(duì)照組縮短,第3天之后增殖速度減慢,提前達(dá)到飽和密度,進(jìn)入平臺(tái)期,第4-5天甚至呈逐漸降低趨勢,使平臺(tái)期不明顯,CoCl2濃度較高(200、250μmol/L)時(shí),細(xì)胞生長曲線趨于低平；bFGF、VEGF基因的表達(dá)具有時(shí)間和劑量依賴性。bFGF mRNA表達(dá)水平在各時(shí)點(diǎn)均明顯高于對(duì)照組(0μmol/L組),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);50μmol/L CoCl2處理后,24、48、72h三個(gè)時(shí)點(diǎn)mRNA表達(dá)水平無顯著差異；100μmol/L CoCl2處理后,隨時(shí)間延長,mRNA表達(dá)水平逐漸增高(P0.05);150μmol/L CoCl2處理后,48h時(shí)點(diǎn)mRNA表達(dá)水平明顯高于24h時(shí)點(diǎn),但72h時(shí)點(diǎn)mRNA表達(dá)水平明顯低于48h時(shí)點(diǎn)。bFGF的蛋白表達(dá)與基因表達(dá)一致,但50μmol/L CoCl2處理組在各時(shí)點(diǎn)沒有顯著差異；VEGF mRNA的表達(dá)各時(shí)點(diǎn)均明顯高于對(duì)照組(0μmol/L組),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),50μmol/L CoCl2處理后,24、48、72h三個(gè)時(shí)點(diǎn)mRNA表達(dá)水平無顯著差異(P0.05);100μmol/L及150μmol/L CoCl2處理后,隨時(shí)間延長,mRNA表達(dá)水平逐漸增高(P0.05),均在48h達(dá)到高峰；在48h時(shí)點(diǎn),150μmol/L組明顯高于100μmol/L組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),bFGF、VEGF的蛋白表達(dá)與基因表達(dá)一致。 結(jié)論適當(dāng)濃度的CoCl2(150μmol/L)對(duì)UC-MSCs的生物學(xué)功能影響輕微。CoCl2可用于細(xì)胞的模擬缺氧,缺氧預(yù)處理對(duì)人UC-MSCs bFGF、VEGF的分泌具有促進(jìn)作用,以含150μmol/L CoCl2的培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h,為促進(jìn)bFGF、VEGF基因和其蛋白表達(dá)的最適條件。
[Abstract]:Objective To investigate the effect of CoCl2 on the biological characteristics of umbilical cord mesenchymal stem cells , and to explore the effect of CoCl2 on the expression of basic fibroblast growth factor ( bFGF ) and vascular endothelial growth factor ( VEGF ) gene and protein secretion in umbilical cord mesenchymal stem cells .


Methods The umbilical cord of caesarean section was collected under aseptic conditions . The umbilical artery and vein were washed with PBS . After cutting to 1mm3 , 0.1 % type 鈪，

本文編號(hào)：1855705