本文選題：臍帶間充質干細胞 + 生長因子�。� 參考：《山東大學》2010年碩士論文

【摘要】： 目的： 人臍帶間充質干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUCMSCs)具有多向分化潛能和自我更新能力,其誘導植入有望成為應用廣泛的細胞治療手段。為了快速獲得足夠數(shù)量的hUCMSCs,研究人員常在培養(yǎng)基中添加生長因子以促進細胞生長。但是當hUCMSCs輸入人體后,沒有添加的生長因子的繼續(xù)作用,細胞的增殖、遷移及定植能力是否會受到影響呢?細胞外基質與細胞的增殖、遷移及定植能力密切相關,因此本實驗研究了細胞外基質的表達情況。 本研究的目的是：1.研究完全撤除表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)、血管內(nèi)皮細胞生長因子(vascular endothelial cell growth factor, VEGF)對細胞增殖及細胞外基質表達的影響。2.保留半量的EGF、bFGF、VEGF是否可以維持細胞增殖及細胞外基質的表達。 方法： 1. hUCMSCs的分離培養(yǎng)及表型鑒定臍帶在采集后6 h內(nèi)用植塊法分離培養(yǎng),每3-4d換液1次,達到80%融合時以細胞密度5×104個/cm2傳代培養(yǎng),取第5代穩(wěn)定生長的hUCMSCs用流式細胞儀進行表型鑒定。 2.實驗分組取第5代hUCMSCs,細胞生長達70%融合時為細胞換液撤除因子,并將細胞分為三組：對照組,生長因子濃度同前；實驗組1,將生長因子濃度突然減半；實驗組2,所換培養(yǎng)基不添加任何生長因子,僅含正常濃度的血清。 3.瑞氏-姬姆薩法染色觀察細胞形態(tài)：將第5代hUCMSCs接種至24孔板,細胞生長達70%融合時按分組為細胞換液,繼續(xù)培養(yǎng)30小時后行瑞氏-姬姆薩法染色觀察細胞形態(tài)。 4.MTT法細胞計數(shù)：按分組將第5代hUCMSCs種植于96孔板,每孔加入5×103個細胞(200μL),在37℃、5%C02條件下孵育30小時后進行MTT法計數(shù)。 5.實時定量PCR (real-time Q-PCR)檢測細胞凋亡相關基因及胞外基質基因的表達。 5.1 Trizol法提取總RNA將細胞接種至6孔板,細胞生長達70%融合時為細胞換液,分上述3組,繼續(xù)培養(yǎng)15小時后吸出培養(yǎng)液,每孔加入Trizol 1 ml,提取總RNA。 5.2紫外分光光度法測所提取總RNA濃度,按說明書進行反轉錄制備cDNA。 5.3實時定量PCR檢測膠原蛋白-Ⅰ(Collagen-Ⅰ, Col-Ⅰ),膠原蛋白-Ⅳ(Collagen-Ⅳ, Col-Ⅳ),纖連蛋白(Fibronectin, FN),層粘連蛋白(Laminin, LN),整合素(Integrin),粘膠蛋白(Tenascin-C),基質金屬蛋白酶-2(MatrixMetalloprotease-2, MMP-2),基質金屬蛋白酶-7(Matrix Metalloprotease-7,MMP-7),基質金屬蛋白酶-9 (Matrix Metalloprotease-9, MMP-9), BCL-2,BAX基因的表達情況。 結果： 1.細胞表形檢測結果 所獲得的貼壁細胞CD34和CD45陰性表達,CD44、CD105、CD71、CD90陽性表達,符合間充質干細胞的特征。 2. hUCMSCs的形態(tài)學觀察 2.1對照組：細胞扁平或長梭形,可見突起,胞核較大,扁卵圓形,染色質細小稀疏著色淺,核仁明顯,胞質較豐富,呈弱嗜堿性,可見嗜堿性顆粒。 2.2實驗組1：細胞扁平或長梭形,部分細胞較對照組變大、變圓,核質比減小。 2.3實驗組2：多數(shù)細胞較對照組變大、變圓,核質比減小 3.MTT法細胞計數(shù)結果 與對照組相比,實驗組2細胞數(shù)目減少,但不具顯著差異(P=0.16)；實驗組1細胞數(shù)目略有增加,亦不具顯著差異(P=0.49)。 4.實時定量PCR結果 4.1凋亡相關基因BCL-2和BAX表達情況撤除生長因子后BCL-2表達上調,BAX表達下調,BCL-2/BAX比率增大,實驗組1較實驗組2 BCL-2表達上調、BAX表達下調幅度更大,BCL-2/BAX比率更高。 4.2胞外基質基因表達情況與對照組相比,半量撤除因子時,Col-Ⅰ、FN、LN、Integrin和Tenascin-C表達增高,完全撤除時Col-Ⅰ、FN表達增高,LN、Integrin和Tenascin-C表達下調。而Col-Ⅳ、MMP-2、MMP-7和MMP-9半量撤除和完全撤除時均減少,完全撤除時減少更多。 結論： 1.撤除EGF、VEGF、bFGF會降低hUCMSCs的增殖能力,保留半量生長因子可以維持hUCMSCs的增殖能力。 2.撤除因子可導致細胞體積變大,核質比減小。 3.撤除因子后,BCL-2/BAX比率增大,細胞的抗凋亡能力增強,半量撤除時細胞的抗凋亡能力較完全撤除時更強。 4.撤除生長因子會影響細胞外基質的表達,而保留半量生長因子可以改善這種情況。
[Abstract]:Objective:
Human umbilical cord mesenchymal stem cells (human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUCMSCs) have multidirectional differentiation potential and self-renewal ability. Their induction implantation is expected to be a widely used cell therapy. In order to obtain a sufficient quantity of hUCMSCs, researchers often add growth factors to promote cell growth in the medium. But when hUCMSCs is inputted to the human body, does the proliferation, migration and colonization of cells affect the proliferation, migration and colonization of the cells without the addition of growth factors? The extracellular matrix is closely related to the proliferation, migration and colonization of cells. Therefore, the expression of extracellular matrix is studied in this experiment.
The purpose of this study is: 1. to study the total removal of epidermal growth factor (EGF), basic fibroblast growth factor (basic fibroblast growth factor, bFGF), and the effect of vascular endothelial growth factor (vascular endothelial cell) on cell proliferation and extracellular matrix expression A half dose of EGF, bFGF and VEGF can maintain cell proliferation and extracellular matrix expression.
Method錛，

本文編號：1844027