本文選題：間充質(zhì)干細胞 + 血管內(nèi)皮細胞��； 參考：《中國醫(yī)科大學(xué)》2010年碩士論文

【摘要】： 目的 促進血管新生、改善微循環(huán)是治療缺血性疾病如冠狀動脈硬化性心臟病、腦血管疾病和周圍動脈閉塞性疾病的關(guān)鍵�！爸委熜匝苌伞笔悄壳靶绿岢龅母拍睿渑c傳統(tǒng)的藥物、介入外科手術(shù)等治療手段不同,是通過模擬體內(nèi)血管生成機制來達到促進血管新生,改善側(cè)支循環(huán)的目的。其中種子細胞來源是血管組織工程的瓶頸,而內(nèi)皮細胞(endothelial cells, ECs)是組織工程化血管中急需解決的種子細胞之一。目前已有研究者從不同干細胞分化ECs,如胚胎干細胞、胚胎的成血管細胞、內(nèi)皮前體細胞(endothelial progenitor cells, EPCs)和多潛能成體干細胞[4],但這幾種細胞系在體內(nèi)含量很少,且受各種因素限制不易獲得。2004年,Oswald等人首次成功在體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)向血管內(nèi)皮細胞分化,因此,MSCs可能成為分化為內(nèi)皮細胞理想的種子細胞來源。但人骨髓中的MSCs含量極低,大約1×104-1×105個單核細胞中含有1個MSC,并且在嚴重感染、骨髓惡性腫瘤或隨著年齡增長的情況下,骨髓MSCs數(shù)量及增殖、分化能力均明顯下降。2004年,Fukuchi等從成熟胎盤小葉中獲得MSCs,后來證明胎盤來源的MSCs(placenta derived mesenchymal stem cells, PDMSCs)具有和骨髓來源的MSCs相似的形態(tài)學(xué)、免疫表型和功能特點。我們實驗室也證明PDMSCs具有向脂肪、軟骨、骨和神經(jīng)分化的潛能。胎盤作為產(chǎn)后“廢棄物”,對其研究不涉及倫理道德問題,且來源豐富。目前國內(nèi)外尚未見PDMSCs向血管內(nèi)皮細胞分化。因此,本實驗將體外分離培養(yǎng)獲得的PDMSCs經(jīng)VEGF和bFGF體外誘導(dǎo)向血管內(nèi)皮細胞分化,并在誘導(dǎo)過程中的不同時間點檢測內(nèi)皮特異性抗原的表達變化和分化的ECs在體外形成血管的能力,為臨床上應(yīng)用PDMSCs移植治療缺血性疾病和構(gòu)建血管組織工程提供實驗依據(jù)。 方法 1、PDMSCs的分離、純化和擴增采用組織塊種植法提取原代,無菌條件下剪碎胎盤組織,然后均勻接種至10cm培養(yǎng)皿,加含10%FBS的DMEM1Oml,37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng),每3d換液一次,待細胞爬出生長至培養(yǎng)皿底部面積的70%-80%時去組織塊傳代,傳2-3代,紅細胞、成纖維細胞等混雜細胞即消失。本實驗選取第3代PDMSCs進行誘導(dǎo)分化及檢測。 2、流式細胞儀分析收集第3代PDMSCs,細胞計數(shù)后取各管為1×106細胞,滴加PE標記的鼠抗人單克隆抗體CD105、CD34和FITC標記的CD166、CD31、CD45 20ul,分別設(shè)PE、FITC、空白對照組,4℃避光孵育30 min,冰PBS洗滌1次,棄上清,加入200 ul PBS吹打混勻細胞,流式細胞儀檢測。 3、體外ECs誘導(dǎo)分化培養(yǎng)選擇傳代純化后培養(yǎng)生長良好的第3代PDMSCs,調(diào)整細胞濃度為3×104cells/ml和1.5×1O5cells/ml分別接種于35mm培養(yǎng)皿和60mm培養(yǎng)皿中,加內(nèi)皮細胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基,置于37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng),每4d換一次新鮮誘導(dǎo)液。 4、光鏡下觀察PDMSCs形態(tài)變化在光學(xué)倒置顯微鏡下觀察PDMSCs誘導(dǎo)后形態(tài)學(xué)變化、增殖情況及排列方式,對比0d、4d、8d、12d的變化。隔天觀察一次。 5、免疫細胞化學(xué)染色以3×104cells/ml密度接種于35mm培養(yǎng)皿中,加誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基培養(yǎng),分別于分化第0d、4d、8d、12d用免疫細胞化學(xué)染色法檢測內(nèi)皮特異性標志CD31、CD144/VE-cadherin、KDR、vWF的蛋白表達情況。棄去培養(yǎng)基,PBS洗3遍4%多聚甲醛固定30min,滴加一抗,4℃孵育過夜,滴加二抗,37℃孵育30min。顯微鏡下觀察拍照。 6、透射電鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)后的細胞用0.25%Trypsin-EDTA消化后,1%鋨酸固定,O.lmol/L PBS漂洗三次,酒精、丙酮梯度脫水：30%酒精-50%酒精-70%酒精-80%丙酮-90%丙酮-100%丙酮。環(huán)氧樹脂浸透、包埋,超薄切片70nm。JEM-1200EX鏡下觀察并拍照。 7、體外血管生成實驗用體外血管生成試劑盒,觀察在半固體Matrix上誘導(dǎo)7d的細胞形成毛細血管樣網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的能力。將Matrix置于4℃融化,24孔板每孔鋪200ul ECMatrix,37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱孵育2h,將誘導(dǎo)7d的PDMSCs以5×104/孔接種到半固體培養(yǎng)基上,2h后開始在倒置顯微鏡下觀察細胞形成管狀結(jié)構(gòu)的形態(tài)。 結(jié)果 1、PDMSCs的原代培養(yǎng)結(jié)果胎盤組織塊接種后,約7d-10d組織塊周圍可見梭形和小圓形兩種貼壁細胞。隨著細胞密度的增加,細胞逐漸變成梭形單層細胞,呈漩渦狀排列,胞體變得大而扁平,形態(tài)類似于成纖維細胞。約14d-21d,細胞生長至70%-80%去組織塊傳代培養(yǎng),傳代細胞穩(wěn)定生長。 2、流式細胞儀檢測第3代PDMSCs高表達MSCs的表面標志CD105(92.87%)和CD166(72.40%),不表達造血系統(tǒng)特異標志CD34和白細胞共同抗原CD45,也不表達內(nèi)皮細胞特異的表面標志CD31。 3、細胞形態(tài)學(xué)和排列方式觀察在倒置和相差顯微鏡下觀察,誘導(dǎo)分化的細胞形態(tài)呈鵝卵石樣,且細胞排列具有一定方向性,呈管腔狀、輪輻狀、條帶狀生長,且細胞呈首尾相接連接在一起。 4、免疫細胞化學(xué)染色結(jié)果 (1)CD31在ECs分化過程的表達變化在PDMSCs向ECs誘導(dǎo)分化的過程中,CD31在4d出現(xiàn)微量表達,但與Od相比無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05),隨著細胞不斷分化,于分化8d CD31表達顯著增強,明顯高于0d、4d、12d(P0.05)，，12d表達減弱。 (2) VE-cadherin/CD144在ECs分化過程的表達變化在PDMSCs向ECs誘導(dǎo)分化的過程中,CD144呈時間依賴性地表達于細胞與細胞之間的粘著小帶,在誘導(dǎo)分化的Od和4d有微量表達,二者相比無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),于分化8d和12d,細胞與細胞之間CD144陽性染色的棕黃色顆粒出現(xiàn)逐漸增多的趨勢。圖像分析表明,PDMSCs向ECs誘導(dǎo)分化的8d和12d,細胞的積分光密度值(IOD)與其他三組有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)，表明CD144可作為內(nèi)皮終末分化的標志來鑒定成熟階段的內(nèi)皮細胞。 (3)vWF在ECs分化過程的表達變化在PDMSCs向ECs誘導(dǎo)分化的過程中,vWF在0d有微量表達,4d表達增強,8d達高峰,之后穩(wěn)定表達。圖像分析表明,PDMSCs向ECs誘導(dǎo)分化的8d和12d,細胞的積分光密度值顯著高于Od和4d(P0.05)。 (4) Flk-1/KDR在ECs分化過程的表達變化Flk-1作為內(nèi)皮細胞的早期標志,在Od即有表達,4d表達最強,隨后表達降低。圖像分析表明,PDMSCs向ECs誘導(dǎo)分化的4d,細胞的積分光密度值顯著高于0d、8d和12d(P0.05),0d、8d和12d三組間無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 5、PDMSCs誘導(dǎo)的ECs超微結(jié)構(gòu)透射電鏡下觀察誘導(dǎo)8d的細胞,可以看見內(nèi)皮細胞典型的細胞膜穴樣凹陷和吞飲小泡,胞漿中可見內(nèi)皮特異性結(jié)構(gòu)Weibel-palade小體。此外,胞漿中可見較多線粒體、高爾基體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和溶酶體等細胞器,提示細胞增殖分化旺盛,核膜和核仁清晰可見。 6、PDMSCs源的內(nèi)皮細胞體外血管生成能力誘導(dǎo)7d的內(nèi)皮細胞接種到細胞外基質(zhì)凝膠(ECMatrigel)中,2h后相鄰的細胞伸出觸突彼此相連,并逐漸通過管狀結(jié)構(gòu)聯(lián)成網(wǎng)狀,5h-6h趨于典型,呈“毛細血管腔”樣結(jié)構(gòu),而未分化的PDMSCs呈散在的細胞,不能形成管樣結(jié)構(gòu)。結(jié)論 1、胎盤組織中可以分離出大量的PDMSCs。 2、PDMSCs在體外可被誘導(dǎo)分化為血管內(nèi)皮細胞,且分化的內(nèi)皮細胞在體外具有遷移和血管形成能力。 3、在PDMSCs向ECs分化過程中,內(nèi)皮特異性標志Flk-1/KDR、CD31、vWF和VE-cadherin/CD144的表達高峰呈一定時間順序性。
[Abstract]:Purpose



In 2004 , Oswald et al . succeeded in inducing bone marrow mesenchymal stem cells ( MSCs ) to differentiate into vascular endothelial cells . Conclusion PDMSCs can be differentiated into vascular endothelial cells by VEGF and bFGF in vitro , and the ability of ECs to form blood vessels in vitro and to provide experimental basis for the clinical application of PDMSCs transplantation in the treatment of ischemic diseases and construction of vascular tissue engineering .



method



1 . The separation , purification and amplification of PDMSCs were used to extract primary and sterile placenta tissues under aseptic conditions . Then , the cells were inoculated into 10 cm culture dish , then cultured under the conditions of DMEM1Oml , 37 鈩

本文編號：1843424