本文選題：乳牙 + 牙髓�。� 參考：《南方醫(yī)科大學》2010年碩士論文

【摘要】： 背景和目的 自組織工程學的概念提出以來,種子細胞、生物支架材料、培養(yǎng)環(huán)境就一直是重要的組成三要素,而其中種子細胞是實現(xiàn)組織修復與再生的前提和基礎。干細胞以其自身獨具的特性在諸多候選種子細胞中顯示出了很大的優(yōu)勢。胚胎干細胞(embryonicstem cells, ESCs)雖然具有分化成所有類型細胞的潛能,但其存在異體移植倫理制約的問題,這也就使得成體干細胞(adultstem cells, ASCs)成為目前組織工程種子細胞的研究熱點,并且已經在促進骨和軟骨缺損修復已及顱面部組織再生方向取得了一定的成果。 在成體干細胞中,乳牙牙髓干細胞(stem cells derived from human exfoliated deciduous teeeh, SHED)是近幾年再生醫(yī)學中又一極具應用潛力的種子細胞,SHED具有離成熟細胞近、可塑性強、免疫排斥小以及高度增殖能力和多向分化的潛能,并且在一定條件下SHED可向特定的細胞類型分化,產生數(shù)個亞系的前體細胞。除此之外目前研究還發(fā)現(xiàn)乳牙牙髓干細胞具有較強的誘導成骨能力,對骨缺損的修復具有十分重要的意義。我們的前期研究發(fā)現(xiàn),將SHED與β-TCP復合培養(yǎng)后植入裸鼠體內可形成典型的軟骨化骨的結構,說明移植材料在沒有任何其他誘因的前提下,可在裸鼠體內自主發(fā)生軟骨成骨。 就目前報道來看,許多成體干細胞都具有向軟骨細胞分化的潛能,有些成體干細胞已經運用于軟骨組織的修復中,但未見SHED是否具有向軟骨細胞分化能力的研究報道。而近些年SHED向成骨細胞分化的研究較多,但這些研究都是基于未特異性選擇的基礎上進行的。因此本課題第一部分旨在探索體外培養(yǎng)SHED在誘導體系的作用下,通過觀察軟骨細胞特異性標記物來確定SHED是否具有向軟骨細胞分化的特性。實驗第二部分,運用流式細胞儀選擇帶有特異性標記的SHED,分不同時間點觀察分選后的細胞自行分化為成骨細胞的過程,目的為后續(xù)的SHED在體內參與軟骨組織及骨組織修復提供一定的參考依據(jù)。 第一章人乳牙牙髓干細胞體外定向誘導向軟骨細胞分化的實驗研究 一、方法 1 SHED的收集和培養(yǎng) 依據(jù)Miura等的實驗方法選取6～10歲健康兒童的滯留的乳牙,采用酶消化法培養(yǎng)細胞。將拔出的牙髓組織通過消化、過濾后得到細胞懸液,然后鋪于細胞培養(yǎng)瓶內培養(yǎng)。 2 SHED的觀察和鑒定 2.1細胞形態(tài)學觀察 觀察原代和傳代細胞生長、增殖情況以及形態(tài)特征,HE染色觀察原代細胞組織學特征。 2.2細胞表面抗原鑒定 對原代細胞行細胞免疫化學染色分析,觀察STRO-1的表達情況。 2.3成脂分化誘導實驗 取原代細胞在成脂誘導液條件下培養(yǎng),觀察到脂滴形成后行油紅-O染色。 3 SHED體外誘導成軟骨細胞 3.1誘導后細胞形態(tài)學觀察 參照Johnstone B等實驗方法對培養(yǎng)的第2代SHED進行誘導2周后,HE染色觀察分化后的細胞的形態(tài)組織學特征。 3.2甲苯胺藍和番紅-O染色 對經誘導分化后的SHED細胞行甲苯胺藍和番紅-O染色觀察分化后的細胞內外糖胺聚糖和蛋白多糖的表達情況。3.3Ⅱ型膠原及Aggrecan的表達情況 對經誘導分化后的SHED細胞行免疫化學細胞染色和免疫熒光染色觀察Ⅱ型膠原及Aggrecan的表達情況 3.4 RT-PCR檢測Ⅱ型膠原基因表達 運用RT-PCR方法檢測定向誘導分化后的SHED細胞內Ⅱ型膠原在基因水平的表達情況。 二、結果 1 SHED的分離和培養(yǎng) 原代培養(yǎng)的細胞一般在鋪瓶3天后倒置顯微鏡下見貼壁細胞生長,形態(tài)呈現(xiàn)多形性。隨著生長傳代,細胞較多的出現(xiàn)梭形成纖維細胞樣并且大小趨近一致。 2 SHED的觀察和鑒定 2.1細胞HE染色觀察 原代細胞爬片HE染色：大部分細胞呈梭形,體積較小,輪廓清晰。細胞核為圓形或卵圓形,體積較大。少數(shù)細胞內可見多個核仁存在。 2.2免疫細胞化學染色檢測細胞表面抗原 對原代培養(yǎng)的SHED行抗STRO-1免疫細胞化學染色,倒置顯微鏡下觀察細胞呈陽性表達。 2.3體外成脂誘導實驗 細胞在成脂誘導體系的的作用下,約15d可見個別細胞胞漿能出現(xiàn)高強度的折射點,20d左右亮點增多并有融合,油紅-O染色呈陽性。 3 SHED體外定向誘導成軟骨細胞 3.1誘導后細胞形態(tài)學觀察 誘導兩周后細胞行HE染色：細胞形態(tài)由梭形變?yōu)檐浌羌毎湫偷亩噙呅涡螒B(tài),細胞體積較小,胞核深染。 3.2甲苯胺藍染色和番紅-O染色 對經向軟骨細胞誘導分化后的SHED細胞行甲苯胺藍和番紅-O染色結果均為陽性。 3.3檢測成軟骨細胞特性標記物 免疫細胞化學染色觀察Ⅱ型膠原呈陽性表達,免疫熒光染色觀察可見Aggrecan有陽性表達。 3.4 RT-PCR檢測Ⅱ型膠原基因表達 誘導2周后可見特異性的Ⅱ型膠原在300-400bp有表達。 三、結論 本實驗成功對人乳牙牙髓干細胞進行原代培養(yǎng),并在體外定向向軟骨細胞誘導后,對細胞形態(tài)及軟骨細胞的表型進行鑒定,證實人乳牙牙髓干細胞在體外具有分化為軟骨細胞的潛能。 第二章人乳牙牙髓干細胞體外成骨特性的實驗研究 一、方法 1 SHED的收集和培養(yǎng)同實驗第一部分 2流式細胞儀分選細胞 當?shù)?代乳牙牙髓干細胞細胞生長融合成單層后,消化制成單細胞懸液加入FITC-CD34和PE-CD117抗體,經流式細胞儀分選出兩組細胞。A組：CD34+/ CD117+雙陽性表達的細胞,B組：剩余的混雜細胞。 3細胞形態(tài)學觀察倒置顯微鏡觀察分選后A、B兩組細胞的生長形態(tài),組織學HE染色觀察。 4免疫細胞化學染色檢測SHED向成骨細胞分化分選后的細胞培養(yǎng)30d時,用免疫細胞化學染色法觀察A、B兩組細胞RUNX-2、OC、BSP的表達。 5熒光定量PCR技術檢測成骨細胞基因表達分選后的細胞培養(yǎng)40 d時,應用MX300p定量PCR儀進行熒光定量PCR實驗,檢測A、B兩組細胞RUNX-2、OC、BSP mRNA的表達情況。 6礦化結節(jié)形成能力的檢測 分選后的A、B兩組細胞培養(yǎng)50 d時運用Von Kossa's礦化結節(jié)染色法和茜素紅染色法檢測。 二、結果 1流式細胞儀檢測細胞表面抗原及分選 CD34+/CD117+的細胞為A組,占總細胞量的40.2%,剩余混雜細胞為B組,占總細胞量的58.5%。 2細胞生長情況 分選后的A、B兩組細胞與分選前的細胞形態(tài)并無太大差別,都是呈長梭形,成集落狀生長,HE染色觀察見細胞為成纖維樣細胞,細胞輪廓清楚,體積較小,胞核呈卵圓形或圓形,著色深,胞漿著色淺。 3免疫細胞化學染色 分選后A、B組的細胞分別制作細胞爬片,免疫細胞化學染色觀察發(fā)現(xiàn)A、B組細胞均有成骨細胞標記物RUNX-2、OC、BSP的表達。 4熒光定量PCR技術檢測RUNX-2、OC、BSP mRNA的表達 熒光定量PCR結果顯示A、B兩組細胞中均可檢測到RUNX-2、OC、BSP mRNA表達,且A組的表達量均高于B組。 5礦化能力的檢測 A、B兩組細胞運用Von Kossa's染色法和茜素紅染色法檢測,結果顯示A組細胞呈陽性表達,B組細胞呈陰性表達。 三、結論 本實驗證實經流式細胞儀分選可以獲得初步純化的CD34+／CD117+雙陽性表達的SHED。純化后的CD34+／CD117+雙陽性表達的SHED具有體外自行向成骨細胞分化和形成礦化結節(jié)的特性。
[Abstract]:Background and Purpose



Embryonic stem cells ( ASCs ) , which have the potential to differentiate into all types of cells , have the potential to differentiate into all types of cells .



In adult stem cells , the stem cells derived from human bone marrow stem cells ( SHED ) are the potential seed cells in regenerative medicine in recent years . SHED has the potential to differentiate into mature cells , has strong plasticity , low immune rejection , high proliferation ability and multi - directional differentiation .



In the present report , many adult stem cells have the potential to differentiate into chondrocytes , some adult stem cells have been used in the repair of chondrocytes , but it is not seen whether SHED has the ability to differentiate into chondrocytes .



An experimental study on the differentiation of human dental pulp stem cells into chondrocytes in vitro



I . Methodology



1 SHED collection and culture



according to the experimental method of Miura et al . , the retained deciduous teeth of 6 - 10 year old healthy children are selected , the cells are cultured by adopting an enzymatic digestion method , and the extracted pulp tissues are digested and filtered to obtain cell suspension , and then are spread in a cell culture bottle culture .



Observation and Identification of 2 SHED



2.1 Cell morphology observation



The histological characteristics of primary and passaged cells were observed by HE staining .



2.2 Cell surface antigen identification



The expression of STRO - 1 was observed by immunochemical staining analysis of primary cell line cells .



2.3 Induction of Adipocyte Differentiation



The primary cells were cultured under the condition of lipopolysaccharide - induced liquid , and the oil - red - O staining was observed after lipid droplets formation .



3 SHED induced chondroblasts in vitro



3.1 Morphological observation of post - induced cell



The morphological and histological characteristics of the differentiated cells were observed by HE staining after 2 weeks of induction of the cultured second generation SHED by reference to the experimental methods such as Johnstone B .



3.2 Methamphetamine and Safranine - O Staining



The expression of both in vitro and in vivo and on the expression of glycans and polysaccharides in the cells after induced differentiation of SHED cells was investigated . The expression of collagen type 鈪，

本文編號：1842197