發(fā)布時(shí)間：2018-05-02 12:14

  本文選題：RraA + 晶體結(jié)構(gòu)�。� 參考：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2010年博士論文

【摘要】： 第一部分RNase E抑制因子RraA的結(jié)構(gòu)和功能研究 RNase E(ribonuclease E,核糖核酸酶E)是廣泛地存在于植物和細(xì)菌細(xì)胞中,是參與眾多功能RNA成熟和mRNA降解代謝過(guò)程中的限速酶。以RNase E為組裝支架,PNPase(核苷酸磷酸化酶)三聚體、RhlB(RNA酶解螺旋酶B)單體以及enolase(烯醇化酶)二聚體的相互作用結(jié)合共同組成mRNA降解體功能復(fù)合物,共同協(xié)調(diào)完成對(duì)mRNA的降解過(guò)程。RraA是至今為止發(fā)現(xiàn)的對(duì)RNase E起抑制作用的調(diào)控因子,已有的研究證實(shí)RraA可與降解體復(fù)合物其它幾種組分PNPase、RhlB和enolase在RNase E的C端非催化區(qū)域結(jié)合位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合,并降低該幾種組分在RNA降解體復(fù)合物中含量達(dá)到其抑制作用。 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征決定其功能的行使。為了進(jìn)一步了解RraA對(duì)降解體功能復(fù)合物在mRNA降解處理過(guò)程中的作用,我們選取臨床上常見的機(jī)會(huì)致病菌-綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)為研究對(duì)象;克隆、表達(dá)、純化并利用氣相擴(kuò)散法結(jié)晶獲得了綠膿桿菌RraA(PaRraA)晶體,使用in house X射線光源收集了一套分辨率為2.0?的衍射數(shù)據(jù);以大腸桿菌(E.coli)RraA(PDB code 1q5x)為結(jié)構(gòu)搭建模型,利用分子置換法(Molecular Replacement,MR)獲得了PaRraA晶體三維空間結(jié)構(gòu)模型(Rfactor =20.8%,Rfree=24.2%,PDB code 3C8O)。通過(guò)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn):PaRraA與已知的其它物種來(lái)源的RraA分子結(jié)構(gòu)相似,為結(jié)構(gòu)保守的蛋白質(zhì)。利用激光光散射實(shí)驗(yàn)和凝膠層析實(shí)驗(yàn)本研究首次證實(shí):PaRraA在溶液中為六聚體形式,符合晶體中的“兩個(gè)三聚體形成的二聚體”這一分子堆積方式;通過(guò)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和序列分析發(fā)現(xiàn):PaRraA六聚體分子含有的六個(gè)帶電荷區(qū)域,提示其可能參與該分子同降解體其它組分-PNPase、RhlB和enolase在RNase E的C端非催化區(qū)域的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合,從而調(diào)節(jié)降解體的降解活性,這為進(jìn)一步理解該分子對(duì)體內(nèi)RNA降解機(jī)制提供了理論依據(jù)。 第二部分細(xì)菌鞭毛hook組裝蛋白FlgD的結(jié)構(gòu)和功能研究 鞭毛是致病菌重要的毒力因子,參與細(xì)菌與宿主的相互作用。細(xì)菌的鞭毛是由超過(guò)50個(gè)基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行組裝和調(diào)控。鞭毛主要由基體(basal body)、鞭毛鉤(hook)和鞭毛絲(filament)三個(gè)部分組成。其中,鞭毛溝(hook)象鉸鏈一樣聯(lián)系鞭毛(filament)和細(xì)胞膜上的鞭毛基體(basal body),由hook蛋白質(zhì)FlgE組裝而成。FlgD是鞭毛hook組裝過(guò)程中重要的支架分子(scaffolding protein);在未成熟的鞭毛hook組裝過(guò)程中,FlgD形成的臨時(shí)“帽子”結(jié)構(gòu)亦可以阻擋hook蛋白FlgE的分泌泄露;另外,FlgD與FliK能共同調(diào)控FlgE聚合方式,使hook的長(zhǎng)度在一定范圍內(nèi)。已有的研究證實(shí):FlgD僅存在于大腸桿菌和沙門氏菌鞭毛hook的組裝期,是鞭毛hook結(jié)構(gòu)組裝過(guò)程中的調(diào)控蛋白。 迄今為止,關(guān)于FlgD蛋白分子的結(jié)構(gòu)信息非常局限,僅有植物致病菌Xanthomonas campestris來(lái)源的FlgD分子結(jié)構(gòu)得以解析,但僅有C端約130個(gè)氨基酸區(qū)域晶體結(jié)構(gòu)信息(XcFlgD; PDB code 3c12)。尚未獲得參與hook組裝過(guò)程中起重要作用的N端結(jié)構(gòu)信息。為了進(jìn)一步了解該分子在鞭毛組裝、調(diào)控等過(guò)程中的生物學(xué)作用,我們以臨床常見的機(jī)會(huì)致病菌-綠膿桿菌為研究對(duì)象,通過(guò)flgd的克隆、表達(dá)、純化、結(jié)晶,并對(duì)FlgD晶體進(jìn)行X射線晶體衍射獲得了母體衍射數(shù)據(jù);利用在上海同步輻射收集的Se-Met多波長(zhǎng)反常散射數(shù)據(jù),應(yīng)用XPREP尋找Se重原子的坐標(biāo),利用Solve解析相位和Resolve進(jìn)行相位優(yōu)化和模型搭建,然后運(yùn)用Coot和Refmac進(jìn)行結(jié)構(gòu)修正,完成了PaFlgD分辨率為2.4?的三維結(jié)構(gòu)的解析(PDB code 3IOA)。實(shí)驗(yàn)獲得了C端131個(gè)氨基酸蛋白質(zhì)分子空間結(jié)構(gòu),與降解實(shí)驗(yàn)獲得的14.5kDa的片段相吻合。獲得的PaFlgD分子結(jié)構(gòu)為兩個(gè)較獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域:Tudor結(jié)構(gòu)域和Fn-Ⅲ結(jié)構(gòu)域雜交組合而形成的結(jié)構(gòu),其中β折疊(β-strand)含量非常豐富,相關(guān)的結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系研究正在進(jìn)行中。
[Abstract]:The first part is about the structure and function of RNase E inhibitor RraA.
RNase E (ribonuclease E, ribonuclease E) is widely existed in plant and bacterial cells, and is the speed limiting enzyme involved in many functional RNA maturation and mRNA degradation and metabolism. RNase E is the assembly scaffold, PNPase (nucleotides phosphorylase) trimer, RhlB (RNA enzymolysis helicase) monomer and two polymer (enolase). The role of the combination of mRNA descending functional complex and co ordination to complete the degradation of mRNA.RraA is a regulatory factor that has been found so far on the inhibition of RNase E. The previous studies have confirmed that RraA can be associated with the other components of the descending complex, PNPase, RhlB and enolase in the RNase E C terminal non catalytic regional binding sites. Competitive combination can reduce the content of these components in RNA degradation complex and achieve its inhibitory effect.
The structural characteristics of protein determine the exercise of its function. In order to further understand the role of RraA in the degradation process of mRNA, we select the common opportunistic pathogenic bacteria, Pseudomonas aeruginosa (Pseudomonas aeruginosa), as the research object; clone, express, purify and use the crystallization of gas phase diffusion to obtain green. Pseudomonas RraA (PaRraA) crystal, using in house X ray light source, collected a set of diffraction data with a resolution of 2?, and the structure model was built with E.coli RraA (PDB code 1q5x), and the three-dimensional spatial structure model of the crystal was obtained by molecular replacement. O). Through structural analysis, it is found that PaRraA is similar to the known RraA molecular structure of other known species and is a structurally conservative protein. It is first confirmed by laser light scattering experiment and gel chromatography experiment that PaRraA is in the form of six polymer in solution, conforming to the "two polymer" of "two trimers" in the crystal. Through protein structure and sequence analysis, it is found that the PaRraA six polymer contains six zone of charge with charge, suggesting that it may participate in the competition of -PNPase, RhlB and enolase in the non catalytic region of C end of RNase E, thus regulating the degradation activity of the descending body, which is a further understanding of the molecule. The mechanism of RNA degradation in the body provides a theoretical basis.
The second part is about the structure and function of bacterial flagellum hook assembly protein FlgD.
Flagellum is an important virulence factor of pathogenic bacteria and participates in the interaction between bacteria and host. The flagellum of bacteria is assembled and regulated by more than 50 genes encoding proteins. Flagellum is mainly composed of three parts, basal body, flagellum hook (hook) and flagellum (filament). Among them, flagellum (hook) is linked to flagella like hinges (FILA). Ment) and the flagellum (basal body) on the cell membrane, which are assembled by hook protein FlgE, are the important scaffolding molecules (scaffolding protein) in the hook assembly process of flagellum. In the process of the immature flagellum hook assembly, the temporary "hat" structure formed by FlgD can block the secretion leakage of the hook protein. The FlgE polymerization can be regulated together to make the length of hook within a certain range. Previous studies have confirmed that FlgD exists only in the assembly period of the flagellate hook of Escherichia coli and Salmonella, and is a regulatory protein in the process of hook structure assembly of flagellum.
So far, the structure information about FlgD protein molecules is very limited, only the FlgD molecular structure of the plant pathogenic bacteria Xanthomonas campestris is analyzed, but only the crystal structure information (XcFlgD; PDB code 3c12) of about 130 amino acid regions of the C end has not been obtained. In order to further understand the biological function of the molecule in the process of flagellum assembly and regulation, we use the common opportunistic pathogenic bacteria - Pseudomonas aeruginosa as the research object, through the cloning, expression, purification and crystallization of flgd, and the X ray diffraction of the FlgD crystal to obtain the matrix diffraction data; and use the Se-Me collected in Shanghai synchrotron radiation. T multi wavelength anomalous scattering data, using XPREP to find the coordinates of Se heavy atoms, using Solve analytical phase and Resolve for phase optimization and model construction, and then using Coot and Refmac to modify the structure, complete the resolution of the three-dimensional structure of PaFlgD with a resolution of 2.4? (PDB code 3IOA). The experiment obtained the 131 amino acid protein molecules on the C end. The spatial structure is consistent with the 14.5kDa fragments obtained by the degradation experiment. The PaFlgD molecular structure obtained is two more independent domains: the structure of the hybrid combination of the Tudor domain and the Fn- III domain, in which the content of beta folds (beta -strand) is very rich, and the related structural and functional relationships are in progress.

【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R378

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