本文選題：乙肝病毒表面抗原 + 基因芯片��； 參考：《復旦大學》2008年博士論文

【摘要】： 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)屬于嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae),是世界上分布最為廣泛的病毒之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計,全球有3.5億乙肝病毒攜帶者,其中約50%在我國,是一個非常嚴重的公共衛(wèi)生問題。乙肝病毒的持續(xù)性感染會導致慢性肝炎(chronic hepatitis),并與肝硬化(liver cirrhosis)以及肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)等一系列肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。在乙肝病毒感染患者的血清中,除了直徑為42nm的成熟病毒顆粒外,還能檢測到大量直徑在22nm,主要由病毒表面抗原(hepatitisB surface antigen,HBsAg)組成的亞病毒顆粒,HBsAg顆粒與病毒顆粒之比能高達1000:1。如此大量且持續(xù)性的病毒包膜蛋白表達是乙肝病毒獨有的特征,至今尚未在其他病毒中發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象。持續(xù)表達的HBsAg是慢性乙肝診斷的一個重要指標,病人血清HBsAg陽性超過6個月即被認為罹患慢性肝炎,而且血清HBsAg的清除也是目前乙肝治療的一個難點。因此,研究HBsAg亞病毒顆粒持續(xù)表達的機制及其對宿主細胞功能的影響,不僅有助于深入了解乙肝病毒的致病機理,而且也為設計和開發(fā)新的針對HBsAg的藥物及制劑提供理論依據(jù)。 為了研究HBsAg持續(xù)性表達對宿主細胞功能的影響,闡明HBsAg在病毒感染和致病機制中的作用,本課題的第一部分利用HepG2細胞構建了乙肝病毒表面抗原主蛋白(hepatitis B small surface antigen,SHBs)的穩(wěn)定表達細胞株(HepG2-S-G2)以及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染載體質(zhì)粒并平行傳代的對照細胞株(HepG2-Neo-F4)。應用基因芯片技術對這兩株細胞基因表達譜的差異進行了比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SHBs表達導致許多細胞基因的表達水平發(fā)生了變化。進一步的功能學分析發(fā)現(xiàn),包括細胞的糖代謝和脂類代謝、細胞的生長和凋亡、細胞骨架和細胞外基質(zhì)形成以及一些細胞內(nèi)重要信號轉(zhuǎn)導通路在內(nèi)的許多細胞功能都受到了不同程度的影響。在這些基因中,淋巴增強結(jié)合因子(lymphoid enhancer-bindingfactor 1,LEF-1)基因的轉(zhuǎn)錄變化最為明顯,而且在有完整HBV病毒顆粒產(chǎn)生的HepG2.2.15細胞中LEF-1基因轉(zhuǎn)錄水平也發(fā)生了同樣趨勢的變化。此外,結(jié)合對HepG2-S-G2細胞基因表達譜的分析結(jié)果,還研究了SHBs表達對細胞功能的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SHBs對細胞蛋白親環(huán)素A(cyclophilin A,CyPA)的分泌具有促進作用。 本課題的第二部分,研究了SHBs對LEF-1基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的分子機制。LEF-1是Wnt信號轉(zhuǎn)導通路中一個關鍵的轉(zhuǎn)錄因子,對Wnt通路下游一系列效應分子的轉(zhuǎn)錄和表達起著調(diào)控作用,從而影響細胞增殖和細胞周期的調(diào)控。細胞轉(zhuǎn)染以及siRNA干擾實驗的結(jié)果均證實SHBs的表達能上調(diào)LEF-1基因的轉(zhuǎn)錄水平。細胞免疫熒光染色實驗發(fā)現(xiàn)SHBs的表達影響了LEF-1蛋白在細胞內(nèi)的分布。在HepG2-Neo-F4對照細胞中,LEF-1蛋白主要分布在細胞核中,而在HepG2-S-G2細胞中,LEF-1蛋白不僅在細胞核中,而且在細胞質(zhì)中也有分布。進一步的研究發(fā)現(xiàn),受到SHBs調(diào)控的是LEF-1基因的截短異構體,而并非其全長蛋白。該截短異構體據(jù)報道具有拮抗全長蛋白行使其正常功能的作用。這些結(jié)果提示,SHBs調(diào)控的LEF-1轉(zhuǎn)錄上調(diào)并不遵循經(jīng)典的Wnt信號轉(zhuǎn)導通路,SHBs對Wnt通路的影響并非激活性的,而是抑制性的。 本課題的第三部分,研究了細胞蛋白CyPA與SHBs相互作用的分子機制及其臨床意義。在轉(zhuǎn)染SHBs的Huh7細胞中發(fā)現(xiàn),SHBs的表達能促進CyPA分泌。該現(xiàn)象同樣存在于HBsAg陽性的轉(zhuǎn)基因小鼠和HBV感染病人體內(nèi),在轉(zhuǎn)基因小鼠和病人血清中CyPA含量較對照均有明顯的升高。為研究胞外CyPA在乙型肝炎發(fā)病機制中的作用,用尾靜脈高壓注射法將SHBs基因注入C57BL/6J小鼠體內(nèi)并使其在肝臟細胞中表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)伴隨CyPA分泌的增加,HBsAg陽性的肝細胞周圍有明顯的炎癥細胞浸潤現(xiàn)象。提示分泌的CyPA可能在乙肝病毒引起的應激反應以及炎癥反應中起到了重要的免疫調(diào)節(jié)作用。此外,通過免疫共沉淀實驗,發(fā)現(xiàn)SHBs與CyPA有直接而且特異性的蛋白-蛋白相互作用。此外,用CyPA抑制劑環(huán)孢霉素A(cyclosporine A,CsA)處理細胞后,SHBs的表達有明顯的下降,提示胞內(nèi)CyPA對于乙肝病毒表面抗原的合成和折疊過程可能是必需的。 本課題從轉(zhuǎn)錄體組學角度系統(tǒng)研究了SHBs持續(xù)表達對肝細胞基因表達譜的影響,揭示了SHBs與LEF-1以及CyPA相互作用新的分子機制。本課題的研究結(jié)果不僅為闡明乙肝病毒表面抗原在肝炎發(fā)病機理中的作用提供了新的理論依據(jù),也為開發(fā)針對HBsAg的藥物提供了新的切入點。
[Abstract]:Hepatitis B virus ( HBV ) belongs to Hepadnaviridae , one of the most widely distributed viruses in the world .


In order to study the effect of the persistent expression of HBsAg on the function of host cells , the effect of HBsAg in viral infection and pathogenic mechanism was clarified . The results showed that the expression level of the gene of hepatitis B small surface antigen ( SHBs ) was most obvious by using HepG2 cells .


LEF - 1 is a key transcription factor in Wnt signaling pathway . The expression of LEF - 1 protein plays a role in regulating the transcription and expression of LEF - 1 . In HepG2 - Neo - F4 control cells , LEF - 1 protein is not only in nucleus but also in cytoplasm .


In the third part of this study , the molecular mechanism and its clinical significance of the interaction of CyPA and SHBs were studied . In the Huh7 cells transfected with SHBs , it was found that the expression of SHBs could promote the secretion of CyPA .


This paper studies the effect of SHBs on the expression profile of liver cells from the transcriptome group , and reveals the new molecular mechanism of the interaction between SHBs and LEF - 1 and CyPA . The results of this study not only provide a new theoretical basis for clarifying the role of hepatitis B virus surface antigen in the pathogenesis of hepatitis , but also provide a new entry point for the development of drugs for HBsAg .

【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R512.62;R392

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 夏偉良;謝海洋;沈巖;吳李鳴;張峰;鄭樹森;;環(huán)孢素和他克莫司在體外對乙型肝炎病毒復制影響的對比研究[J];中華醫(yī)學雜志;2006年02期

2 王曉輝;;Wnt信號通路與乳腺癌[J];中國腫瘤;2006年11期

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本文編號：1820350