本文選題：甘露聚糖結(jié)合凝集素 + T淋巴細胞��； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2008年博士論文

【摘要】： 甘露聚糖結(jié)合凝集素(mannan-binding lectin,MBL)是由肝細胞產(chǎn)生的血漿蛋白,為C型凝集素超家族中膠凝素(collectins)家族成員,具有補體C1q的“郁金香”樣結(jié)構(gòu)。成熟MBL肽鏈自N端至C端依次有4個結(jié)構(gòu)域:富含Cys的N端區(qū)、膠原樣區(qū)(collagen-like region,CLR)、頸區(qū)和C端糖識別域(carbohydrate-recognition domain,CRD)。人的完整MBL分子是同質(zhì)三肽鏈結(jié)構(gòu)單位的寡聚體,多至六聚體。只有高寡聚體MBL分子才具有生物學(xué)活性。MBL可選擇性識別多種病原體的糖結(jié)構(gòu),通過激活補體凝集素途徑而發(fā)揮溶破和間接調(diào)理功能,并能與吞噬細胞膠凝素受體(即C1qR)結(jié)合而啟動調(diào)理吞噬,還可介導(dǎo)MBL依賴的細胞介導(dǎo)的細胞毒作用;而且,MBL也是一個重要的粘膜表面防御分子。多種著名雜志如Science、Jounal of Immunology等刊文稱MBL為“天然免疫系統(tǒng)中的關(guān)鍵分子”,凝集素途徑是“天然免疫的關(guān)鍵成份”。 十余年來,隨著對天然免疫研究的深入,特別是初步研究提示天然免疫對獲得性免疫應(yīng)答還有一定的影響,人們對天然免疫系統(tǒng)的傳統(tǒng)認識發(fā)生了根本性的轉(zhuǎn)變�，F(xiàn)代免疫學(xué)認為,天然免疫系統(tǒng)不僅僅能夠通過誘導(dǎo)必要的急性反應(yīng)來清除病原微生物,而且還能夠通過配體識別和分泌細胞因子等方式觸發(fā)適當(dāng)?shù)墨@得性免疫應(yīng)答,并認為天然免疫系統(tǒng)對外來入侵病原體的初次應(yīng)答狀態(tài),決定了后續(xù)獲得性免疫應(yīng)答的性質(zhì)。天然免疫模式識別受體(patten recognitionreceptor,PRR)通過分析外來入侵病原體的危險程度,啟動對宿主的保護程序。單核細胞(monocyte,Mo)、巨噬細胞(macrophage,Mφ)及樹突狀細胞(dendriticcell,DC)作為某些應(yīng)答的直接介導(dǎo)者,能夠感知外來危險信號并在其刺激下分泌一些炎性細胞因子,細胞因子環(huán)境進一步影響后續(xù)的獲得性免疫應(yīng)答。正常情況下,機體天然免疫分子能夠清除自身凋亡的細胞或壞死的組織進行組織修復(fù),維持機體代謝平衡,因此在沒有危險信號情況下,天然免疫分子能夠通過鑒別自身凋亡細胞,避免誘導(dǎo)一些能夠引起自身免疫病的獲得性免疫應(yīng)答,扮演獲得性免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)者的角色。 現(xiàn)已發(fā)現(xiàn),膠凝素家族的其他成員如肺表面活性物質(zhì)蛋白A和D(surfactantProtein A、surfactant protein D,SP-A、SP-D)及補體C1q具有多種免疫調(diào)節(jié)功能,如SP-A能夠抑制DC的成熟和分化,通過與CD14分子相互作用觸發(fā)細胞應(yīng)答,并能夠抑制脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的單核巨噬細胞分泌TNF-α等細胞因子,還可以直接與Toll樣受體-4(Toll-like receptor 4,TLR4)、MD-2分子相互作用來調(diào)節(jié)炎性細胞反應(yīng);SP-D能夠加強抗原提呈;C1q則可以直接調(diào)節(jié)DC的成熟與分化并能夠抑制LPS誘導(dǎo)的細胞因子產(chǎn)生。MBL作為天然免疫的關(guān)鍵分子,已被報道能夠調(diào)節(jié)多種細胞因子的表達,但是到目前為止,對MBL在獲得性免疫應(yīng)答中的作用幾無所知。根據(jù)MBL與SP-A、SP-D的同源性、都能與膠凝素受體結(jié)合及已發(fā)現(xiàn)Mφ表達特異性膠凝素受體并介導(dǎo)多種免疫調(diào)節(jié)功能的情況,推測MBL必定參與獲得性免疫應(yīng)答。針對此設(shè)想,本課題組陳月博士已經(jīng)作了大量相關(guān)研究,并得出結(jié)論:MBL對DC的分化成熟有一定的影響。聯(lián)想到DC作為機體內(nèi)最重要的抗原提呈細胞(antigen presentingcell,APC)在啟動獲得性免疫應(yīng)答起著關(guān)鍵作用,提示MBL極有可能參與調(diào)節(jié)獲得性免疫應(yīng)答。 因此,在現(xiàn)有研究基礎(chǔ)之上,本課題繼續(xù)探討MBL在調(diào)節(jié)獲得性免疫應(yīng)答中所扮演的角色。我們首先聯(lián)合應(yīng)用配體和抗體親和層析柱子,從人新鮮冰凍血漿中提取高純度的具有生物學(xué)活性的天然MBL,并原核表達了可溶性TLR4胞外段蛋白(sTLR4),然后對MBL負向調(diào)控LPS誘導(dǎo)的DC功能效應(yīng)做了初步的機理分析;又選擇人B細胞系Raji細胞作為研究對象,分析MBL與其相互作用的特性及其對細胞功能的影響;又原核表達了模式抗原破傷風(fēng)毒素C蛋白(TTC),探討了MBL對PHA、PMA或PMA/ionomycin活化的人T細胞系Jurkat細胞、外周血單個核細胞(peripheral blood monoeuclear cell,PBMC)、外周血新鮮分離的CD3~+T淋巴細胞的增殖及分泌細胞因子的影響,并分析了MBL對DC提呈TTC抗原能力的影響。本研究分4部分,茲分述如下。 一、聯(lián)合應(yīng)用配體和單克隆抗體親和層析純化人血漿天然MBL蛋白 MBL是天然免疫系統(tǒng)的一個重要分子,許多有關(guān)凝集素途徑及其相關(guān)疾病的理論研究、臨床疾病病人血清中MBL水平測定和抗MBL單克隆抗體(monoclonal antibody,mAb)制備等實際工作中,都需要高度純化的MBL制劑。然而,血漿中MBL濃度很低,正常人在40～3500μg/L之間,平均約900μg/L,血漿成份又非常復(fù)雜,獲得高純度MBL比較困難。 為獲取高純度天然MBL,本研究優(yōu)化了傳統(tǒng)提純MBL的方法。制備了抗人MBL-CRD mAb-Sepharose 4B親和層析柱,聯(lián)合采用配體甘露聚糖-Sepharose4B親和層析柱,將預(yù)處理人血漿3次上柱親和層析分離,分別用EDTA、D-甘露糖、Gly-HCl(pH 2.4)溶液洗脫結(jié)合蛋白。以SDS-PAGE、Western blot和ELISA等技術(shù)鑒定純化產(chǎn)物。試驗結(jié)果顯示,所獲純化MBL為28 KD和32 KD肽鏈構(gòu)成的功能性寡聚體,其純度較高,可與配體甘露聚糖結(jié)合并有效凝集酵母菌,還能與U937細胞膠凝素受體結(jié)合。本文報道的血漿預(yù)處理技術(shù)然后采用甘露聚糖-Sepharose 4B親和層析柱和抗人MBL-CRD mAb-Sepharose 4B親和層析柱聯(lián)合層析技術(shù),可以獲得高純度、高活性的MBL蛋白,為后續(xù)研究奠定了堅實的物質(zhì)基礎(chǔ)。 二、MBL調(diào)節(jié)DC功能的機制初步研究 TLR是天然免疫系統(tǒng)中重要的模式識別受體,不僅能夠介導(dǎo)對病原微生物及其產(chǎn)物的識別,而且能夠參與獲得性免疫應(yīng)答,被視為聯(lián)系天然免疫和獲得性免疫的橋梁。在所有的TLR家族中,TLR4在未成熟DC(immature dendriticcell,imDC)、Mo及Mφ廣泛表達,而且在識別LPS及其所介導(dǎo)的信號途徑中起著關(guān)鍵作用。 本課題組陳月博士研究發(fā)現(xiàn),MBL對LPS誘導(dǎo)的imDC的成熟、細胞因子產(chǎn)生具有負向調(diào)控作用,但其作用機理并不明了。本研究繼續(xù)陳月博士的工作,以TLR4為切入點,探討MBL對LPS/TLR4介導(dǎo)的信號途徑的影響,進一步分析MBL對DC功能調(diào)節(jié)的機理。 實驗中首先原核表達了可溶性TLR4胞外段蛋白(sTLR4),以蛋白質(zhì)印跡試驗(Western blot)鑒定其特異性;接著用Western blot和ELISA兩種方法分析MBL是否與sTLR4相互作用,并用流式細胞術(shù)(FCM)分析MBL與imDC的結(jié)合情況,競爭性抑制試驗分析MBL是否結(jié)合imDC表面的TLR4受體及影響后續(xù)LPS/TLR4介導(dǎo)的信號途徑。實驗結(jié)果顯示:(1) MBL可以直接以濃度依賴方式與可溶性TLR4蛋白胞外段結(jié)合;(2) MBL能夠以Ca~(2+)依賴方式結(jié)合imDC,這種結(jié)合能被sTLR4蛋白及抗TLR4 mAb所抑制;(3) MBL能夠競爭性抑制LPS結(jié)合imDC;(4) MBL能夠抑制LPS誘導(dǎo)的核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)活性。資料表明,MBL可通過結(jié)合imDC表面TLR4受體來調(diào)節(jié)LPS/TLR4介導(dǎo)的信號通路,提示MBL和TLR4之間存在聯(lián)系,在免疫調(diào)節(jié)中扮演重要的角色。 三、MBL對Raji細胞作用特性的研究 作為關(guān)鍵的天然免疫分子之一,MBL還能以鈣離子依賴、糖特異的方式結(jié)合自身的Mo、DC,影響細胞因子的表達,提示MBL在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用,并極有可能參與獲得性免疫應(yīng)答。前文報道了MBL對DC的調(diào)節(jié)作用,而T、B淋巴細胞是獲得性免疫應(yīng)答的介導(dǎo)者,但迄今未見MBL直接與淋巴細胞相互作用而參與調(diào)節(jié)獲得性免疫應(yīng)答的報道。因此,研究MBL與淋巴細胞之間的相互作用具有重要意義。 本實驗中,我們選擇人B淋巴系Raji細胞作為對象,研究MBL是否與其結(jié)合及其結(jié)合特性,并對這種相互作用的后果進行了簡單分析,為探索MBL直接參與B細胞介導(dǎo)的獲得性免疫應(yīng)答提供初步的依據(jù)。實驗中首先采用細胞ELISA方法分析MBL能否與Raji細胞結(jié)合,并采用FCM著重研究其與Raji細胞結(jié)合特性。結(jié)果顯示,MBL以濃度依賴方式結(jié)合Raji細胞;MBL與Raji細胞的結(jié)合是Ca~(2+)依賴的,且能被甘露糖、葡萄糖、N-乙酰葡糖胺所抑制;C1q或抗C1qR mAb能部分抑制MBL與Raji細胞結(jié)合;重組人MBL-CRD蛋白或MBL-CLR蛋白均能抑制MBL與Raji細胞結(jié)合,兩者聯(lián)合應(yīng)用則可完全阻斷這種結(jié)合。資料表明,B淋巴細胞系Raji細胞表達Ca~(2+)依賴性、糖敏感的MBL受體(或結(jié)合蛋白),包括對CLR特異和CRD特異的兩種受體,前者為MBL和C1q的共同受體。進一步的功能研究顯示,高濃度MBL(10～50 mg/L)對Raji細胞的生長具有明顯抑制作用,且呈劑量依賴關(guān)系。提示MBL作為一種重要的模式識別分子,不僅發(fā)揮天然免疫功能,而且可能在調(diào)節(jié)B細胞介導(dǎo)的獲得性免疫應(yīng)答中起一定作用。 四、MBL調(diào)節(jié)T淋巴細胞功能的初步研究 近年發(fā)現(xiàn),與MBL同為C型凝集素超家族中膠凝素家族成員的SP-A和SP-D可抑制絲裂原激活的T細胞增殖,并下調(diào)其分泌IL-2;SP-A對T細胞增殖的抑制作用發(fā)生在絲裂原處理T細胞24 h之后;SP-A和SP-D也能調(diào)節(jié)DC的功能,如SP-A抑制DC的分化成熟,SP-D增強DC的提呈抗原能力,促進抗感染獲得性免疫應(yīng)答。然而,有關(guān)MBL免疫調(diào)節(jié)作用的報道極少,尤其未見其對T淋巴細胞直接調(diào)節(jié)作用的報道。根據(jù)膠凝素家族各成員之間的結(jié)構(gòu)和功能同源性,我們推測MBL很可能對T細胞的增殖及功能也有影響。因此,本實驗探討了在體外MBL對T細胞的調(diào)節(jié)的可能性。 破傷風(fēng)毒素(tetanus toxoid,TT)能激活CD4~+T淋巴細胞,因而被作為一種模式抗原,在CD4~+ T細胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答的研究中廣為應(yīng)用。然而,傳統(tǒng)的破傷風(fēng)類毒素(tetanus toxoid,TToid)是經(jīng)甲醛脫毒而成,而破傷風(fēng)桿菌可形成芽孢且毒性高,生產(chǎn)過程中有一定危險;甲醛處理TT易造成污染,TToid還可能發(fā)生毒性逆轉(zhuǎn)。因此,TToid的研究應(yīng)用受到一定限制。而TT的C片段(TTC)在動物實驗中能有效誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體并可耐受外毒素攻擊,也可激活CD4~+T細胞,是理想的破傷風(fēng)亞單位候選疫苗,且具較好的安全性。因此,本研究選擇TTC作為模式抗原,研究MBL調(diào)節(jié)T細胞介導(dǎo)的獲得性免疫應(yīng)答。 本實驗中,首先原核表達了模式抗原TTC蛋白,并對其抗原性、免疫原性進行分析,得到高度純化、免疫原性良好的TTC蛋白,為后續(xù)研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。然后,采用密度梯度離心法自成年健康自愿者外周血分離單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC),并采用尼龍毛柱分離CD3~+T淋巴細胞。用非特異性刺激物PHA、PMA或PMA/ionomycin等分別活化人T淋巴細胞株Jurkat細胞、PBMC及CD3~+T淋巴細胞,FCM測MBL對PHA、PMA活化的Jurkat細胞及CD3~+T淋巴細胞結(jié)合能力,WST-1和ELISA檢測MBL對PHA、PMA或PMA/ionomycin活化的Jurkat細胞、CD3~+T淋巴細胞及PBMC的增殖及分泌細胞因子IL-2或IFN-γ的影響;然后體外誘導(dǎo)DC和TTC特異性CD4~+T淋巴細胞,WST-1法分析MBL對APC刺激同種異體T淋巴細胞及提呈模式抗原TTC能力的影響。結(jié)果表明,MBL能夠結(jié)合PHA、PMA活化Jurkat細胞及CD3~+T淋巴細胞,MBL能夠以濃度依賴的方式抑制PHA、PMA或PMA/ionomycin活化的上述各組細胞增殖及其分泌細胞因子IL-2或IFN-γ,同時MBL下調(diào)APC刺激同種異體T淋巴細胞增殖并減弱DC對TTC抗原的提呈能力,提示MBL能夠負向調(diào)節(jié)T細胞介導(dǎo)的獲得性免疫應(yīng)答。 上述研究結(jié)果顯示,MBL可直接與DC表面的TLR4相互作用,調(diào)節(jié)后續(xù)的NF-κB信號通路,提示MBL可能通過與TLR4相互作用來調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。MBL還能直接調(diào)控T淋巴細胞、B淋巴細胞的功能,并負向調(diào)節(jié)控APC的抗原提呈能力,提示MBL可能通過T淋巴細胞、B淋巴細胞和抗原提呈細胞三個環(huán)節(jié)來調(diào)控獲得性免疫應(yīng)答。目前,國內(nèi)外尚未見與之類似的報道,盡管其詳細的作用機制有待于進一步的實驗研究加以闡明。這些發(fā)現(xiàn)為進一步探索MBL參與獲得性免疫應(yīng)答的作用及其機制提供了新的切入點,后續(xù)MBL免疫調(diào)節(jié)作用的特性分析、分子機制及信號傳導(dǎo)途徑的闡明,將進一步揭示MBL這種重要天然免疫分子的生物學(xué)意義。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R392

【引證文獻】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 張京芬;MBL介導(dǎo)的人角膜上皮細胞對煙曲霉菌的固有免疫反應(yīng)[D];青島大學(xué);2011年

2 王曉雪;IL-6與IL-10在大鼠真菌性角膜炎固有免疫階段角膜上皮組織中的表達[D];青島大學(xué);2012年

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本文編號：1819581