本文選題：骨髓間充質(zhì)干細胞 + miRNA�。� 參考：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2009年碩士論文

【摘要】： 目的通過檢測人骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)及其誘導(dǎo)分化的軟骨細胞中miRNA基因的表達譜,篩選出誘導(dǎo)分化前后差異表達的miRNAs,尋找可能的人BMSCs向軟骨分化過程中具有調(diào)控作用的miRNAs,為進一步闡明miRNA在BMSCs軟骨分化過程中的作用和意義提供實驗基礎(chǔ)。 方法(1)利用密度梯度離心法自人骨髓中分離BMSCs,在體外擴增傳代培養(yǎng),通過對其形態(tài)特點的觀察及細胞表面標志物檢測,對培養(yǎng)的人BMSCs進行鑒定。(2)采用體外細胞團三維培養(yǎng)方法,用含有TGF-β1、地塞米松、胰島素、牛血清白蛋白和維生素C的培養(yǎng)液誘導(dǎo)人BMSCs向軟骨細胞方向分化,通過甲苯胺藍、s-100蛋白免疫組織化學(xué)染色對誘導(dǎo)分化的軟骨細胞進行鑒定。(3)利用miRNA基因芯片技術(shù),檢測人BMSCs及其誘導(dǎo)分化的軟骨細胞miRNAs的表達譜,通過SAM軟件分析篩選出人BMSCs和其分化的軟骨細胞之間表達差異性的miRNAs。(4)采用實時定量PCR方法對篩選出的差異表達的miRNA基因進行驗證并預(yù)測其潛在的靶基因。 結(jié)果(1)經(jīng)骨髓分離培養(yǎng)所得到的細胞,通過流式細胞儀檢測的結(jié)果為:細胞表面標志物CD29、CD44為陽性,CD34、CD45為陰性,符合骨髓間充質(zhì)干細胞特征。(2)人BMSCs經(jīng)TGF-β1、地塞米松、胰島素、牛血清白蛋白和維生素C誘導(dǎo)21天后,甲苯胺藍、s-100蛋白免疫組織化學(xué)染色均陽性,符合軟骨細胞的特征。(3)用miRNA基因芯片檢測了兩組樣品中人BMSCs及其誘導(dǎo)分化的軟骨細胞miRNAs的表達譜,并篩選出了在該兩種細胞中表達的差異性的miRNAs。在兩組樣品中,軟骨細胞較BMSCs高表達的miRNAs分別為:26個、7個(兩組共同存在的為5個);軟骨細胞較BMSCs低表達的miRNAs在兩組樣品中分別為:1個、2個(兩組共同存在的為0個)。(4)針對篩選出的4個在軟骨中高表達的miRNAs利用實時定量PCR的方法在第3組樣品中進行驗證,結(jié)果均與芯片檢測的結(jié)果一致。 結(jié)論(1)用密度梯度離心法可以從骨髓中分離得到人BMSCs,并可在體外培養(yǎng)將其誘導(dǎo)分化為軟骨細胞。(2)來自不同個體的人BMSCs及其誘導(dǎo)分化的軟骨細胞之間miRNAs的表達存在很大差異性(3)在人BMSCs和其誘導(dǎo)分化的軟骨細胞之間存在表達差異的miRNAs,這些差異性的miRNAs可能對人BMSCs的軟骨誘導(dǎo)分化起著一定的調(diào)控作用。
[Abstract]:Objective to detect the expression profile of miRNA gene in human bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) and its differentiated chondrocytes. The differentially expressed miRNAss before and after differentiation were screened, and the possible miRNAss which could regulate the differentiation of human BMSCs into chondrocytes were found, which provided the experimental basis for further elucidating the role and significance of miRNA in the process of BMSCs cartilage differentiation. Methods BMSCs were isolated from human bone marrow by density gradient centrifugation and cultured in vitro. Human BMSCs was identified by means of morphological observation and cell surface marker detection. Human BMSCs was induced to differentiate into chondrocytes by medium containing TGF- 尾 1, dexamethasone, insulin, bovine serum albumin and vitamin C. The differentiation of chondrocytes was identified by immunohistochemical staining of toluidine blue-100 protein. The miRNAs expression profile of human BMSCs and its differentiated chondrocytes was detected by miRNA gene chip technique. The differential expression of human BMSCs and its differentiated chondrocytes was screened by SAM software. MiRNas. 4) the differentially expressed miRNA genes were verified by real-time quantitative PCR and their potential target genes were predicted. Results 1) the cells isolated from bone marrow were detected by flow cytometry. The results of flow cytometry showed that CD29 + CD44 was positive and CD34 + CD45 was negative, which was consistent with the characteristics of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs). Human BMSCs was transfered by TGF- 尾 _ 1, dexamethasone, insulin, and the results were as follows: (1) TGF- 尾 _ 1, dexamethasone and insulin were detected by flow cytometry. After induction of bovine serum albumin (BSA) and vitamin C for 21 days, the immunohistochemical staining of toluidine blue-100 protein was positive. According to the characteristics of chondrocytes, the miRNAs expression profiles of human BMSCs and chondrocytes induced by chondrocytes in two groups were detected by miRNA gene chip, and the differentially expressed miRNAs were screened out in the two groups of chondrocytes. In two sets of samples, There were 26 chondrocytes with higher miRNAs expression than BMSCs, 7 chondrocytes (5 chondrocytes co-existed in chondrocytes), and 1 chondrocyte miRNAs with lower expression than BMSCs in two groups. Four highly expressed miRNAs in cartilage were verified by real-time quantitative PCR in group 3. The results are consistent with the results of chip detection. Conclusion: human BMSCs can be isolated from bone marrow by density gradient centrifugation and can be induced to differentiate into chondrocytes in vitro. There are significant differences in the expression of miRNAsbetween human BMSCs and chondrocytes induced by BMSCs, and these differential miRNAs may play a role in regulating the differentiation of human BMSCs.
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R329

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本文編號：1814658