本文選題：噬菌體表面展示 + 干擾素α��； 參考：《中國疾病預防控制中心》2009年博士論文

【摘要】：系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus,SLE)是一種嚴重威脅人類健康的自身免疫疾病,研究表明人干擾素α (huIFN-α)與該疾病的發(fā)生有密切關系,這使其成為SLE臨床治療中重要的靶點分子,通過設計藥物分子阻斷IFN-α和受體結合,有望起到緩解和治療SLE的目的。 由于huIFN-α是一種自身免疫原,在健康人體內(nèi)不能刺激人產(chǎn)生抗體,因此不能構建免疫抗體庫來篩選基因工程抗體。本研究以噬菌體表面展示技術為平臺,從人源全合成抗體庫中針對人干擾素α1b (huIFN-α1b)和α2b (huIFN-α2b)篩選抗人干擾素α的基因工程單鏈抗體,具體實驗包括3個部分： 一、抗人干擾素抗體的篩選、表達與鑒定 針對高純度的人干擾素huIFN-α1b蛋白分子,采用高通量的富集篩選策略,從2×109庫容量的全合成人源抗體庫中挑選了3000個克隆,其中20%針對IFNα1b呈陽性反應,有86株經(jīng)phage ELISA驗證對IFNα-1b, IFNα-2b,γ-干擾素,BSA抗原的反應,只對IFN α1b有特異性結合。通過對抗體的CDR3區(qū)的序列分析,根據(jù)抗體在CDR3的長度和序列上都不同,分別屬于9個完全不同的單鏈抗體基因,其中有7株抗體輕重鏈可變區(qū)序列分類在VH3和VL3家族,有2株抗體輕重鏈可變區(qū)序列分類在VH3和VL1家族。通過phage-ELISA對9株噬菌體單鏈抗體的結合特異性和穩(wěn)定性進行驗證,結果獲得了5株穩(wěn)定且特異針對huIFN-α1b而與huIFN-α2b和huIFN-γ無交叉反應的人源單抗。 將5株噬菌粒載體上的抗體基因克隆到scFv單鏈抗體原核表達載體pET22b,單鏈抗體蛋白通過pel序列引導,分泌到細菌的周質腔中,對周質腔中的scFv抗體蛋白采用金屬螯合層析技術進行分離、純化,從600ml培養(yǎng)基中得到了4mg以上的scFv單鏈抗體。通過ELISA和Western blot對5株單鏈抗體的結合特異性進行鑒定,得到3株與huIFN-α1b結合而與huIFN-α2b和huIFN-γ無交叉反應的人源單抗。 將抗體的輕鏈和重鏈基因克隆到pAc-K-CH3載體系統(tǒng),在桿狀病毒/昆蟲細胞表達系統(tǒng)中表達全抗體蛋白,最終通過免疫熒光和SDS-PAGE分析,證明在桿狀病毒/昆蟲細胞表達系統(tǒng)中,全抗體基因在昆蟲細胞中高效分泌表達。表達的IgG全抗體蛋白采用proteinA親和層析進行純化,從1L培養(yǎng)基中得到20mg純度在90%以上的純化的全抗體蛋白。進一步通過ELISA和Western blot對全抗體的結合特異性進行鑒定,得到3株與huIFN-α1b結合而與huIFN-α2b和huIFN-γ無交叉反應的人源全抗體蛋白。 二.抗體的表位、親和力和功能活性鑒定 采用競爭ELISA對3株抗體與抗原結合表位的相互關系進行鑒定,結果表明,全抗體AIFNal IgG1能夠與3株單鏈抗體AIFNalscFv1、AIFNalscFv2、 AIFNalscFv3競爭huIFN-α1b的表位,表明3株抗體與抗原h(huán)uIFN-α1b的結合表位存在相互重疊的關系。采用競爭ELISA對3株全抗體與一株具有廣泛結合人工型干擾素的鼠源單抗4G10與抗原抗原h(huán)uIFN-α1b結合表位的相互關系進行鑒定,結果表明,3株全抗體與鼠源單抗4G1d在抗原h(huán)uIFN-α1b的結合位置上存在重疊的區(qū)域,間接提示3株抗體也具有中和干擾素生物學功能的活性。采用BIAcore對抗體與抗原的結合活性的測定表明,這幾株抗體(AIFNal IgG1、 AIFNal IgG2和AIFNal IgG3)與huIFN-α1b的親和力KD分別為74.7×10-9、5.44×10-9、11.4×10-9,與干擾素的親和力可以達到干擾素與受體的親和力水平,為幾株高親和力的抗體。候選了受huIFN-α調控的基因ISG15和IFIT-1,采用Real-time PCR(實時定量PCR)驗證干擾素.alb與其抗體在下游信號通路上的作用,結果表明在4小時時就能檢測到抗體對ISG15和IFIT-1的表達有下調作用,且這種下調作用有劑量依賴效應,證明了抗體AIFNal IgG1能夠阻斷huIFN-α對下游基因ISG15和IFIT-1的誘導,間接說明了抗體是有功能活性的抗體。為了研究抗體所針對的抗原的功能表位,我們采用WISH-VSV系統(tǒng),按微量細胞病毒抑制法進行了干擾素抗病毒活性中和實驗,結果表明,3株抗體(AIFNal IgG1、AIFNal IgG2和AIFNal IgG3)在濃度達到200ug/ml時不能中和干擾素抗病毒活性,而對照鼠源單抗4G10在濃度達到100ug/ml時即能夠中和干擾素抗病毒活性,這從抗體的生物學活性方面說明抗體所針對huIFN-α1b表位不是干擾素發(fā)揮抗病毒活性的表位。 三.抗體-抗原相互作用的研究 為了研究抗原-抗體的相互作用關系,我們將干擾素基因克隆pET30a,在大腸桿菌細胞中表達了人干擾素蛋白huIFN-α1b,表達的蛋白通過Western Blotting鑒定抗原表位。通過在干擾素基因上引入缺失突變,證明IFNalb的LoopAB區(qū)(29-35)在抗原-抗體相互作用中起有關鍵的作用,對該區(qū)域與相鄰區(qū)域的氨基酸的定點突變和westernblot分析表明,IFN的27位的S,33位的D,34位的R,35的H,36位的D突變后,抗體與抗原的結合可減弱到不可檢測的水平,為抗原-抗體相互作用的關鍵的氨基酸殘基。以已有的干擾素a2b結晶的X-ray衍射3D結構模型為模板(huIFN-α1b和huIFN-α2b的序列相似性為83%),在Discovery Studio(DS)圖像模擬系統(tǒng)中用protein moldeling程序構建了干擾素alb分子的模型。以抗體結構模型2A9M(2A9M和AIFNalscFvl的序列相似性為77%)為骨架,在Discovery Studio(DS)圖像模擬系統(tǒng)中搭建完整抗體蛋白的結構模型,對得到的結構采用Chamm程序對力場進行優(yōu)化,得到抗體能量最低的結構模型。在Discovery Studio(DS)圖像模擬系統(tǒng)中,采用Z-dock程序,在高速的服務器上完成抗原-抗體結構的對接。分析對接的試驗結果,參照RMSD、 E_Rdock等參數(shù),得到了比較合理的對接試驗結果,并且這一結果與表位研究的結果一致。 綜上所述,本研究運用噬菌體表面展示技術,在國際上首次從人源全合成抗體庫中成功獲得了3株特異性針對人干擾素alb的高親和力人源基因工程單克隆抗體,其中有一株通過體外實驗證明具有免疫調節(jié)的作用,并首次采用分子建模與表位圖譜鑒定相結合的方法對干擾素α、干擾素a受體和干擾素抗體的結構關系進行了研究,對抗體的功能活性從結構學上進行了解析。本研究為緩解和治療SLE帶來了希望,對研究干擾素結構和功能的關系具有重要意義,為SLE分子機理的研究提供了基礎。
[Abstract]:Systemic lupus erythematosus ( SLE ) is a kind of autoimmune disease which threatens human health seriously . The study shows that human interferon 偽 ( huIFN - 偽 ) is closely related to the occurrence of the disease , which makes it an important target molecule in SLE clinical treatment .

Human interferon 偽1b ( huIFN - 偽1b ) and 偽2b ( huIFN - 偽2b ) were screened against human interferon 偽1b ( huIFN - 偽1b ) and 偽2b ( huIFN - 偽2b ) .

1 . Screening , expression and identification of anti - human interferon antibodies

A high - throughput screening strategy of human interferon huIFN - 偽1b was used to select 3000 clones from the total synthetic human antibody library of 2 脳 109 cubage .

The antibody gene of 5 strains of phage particles was cloned into the prokaryotic expression vector pET22b of scFv single - chain antibody . Single - chain antibody protein was secreted into the periplasm cavity of bacteria through pel sequence . The scFv antibody protein in periplasm was isolated and purified by metal chelate chromatography . The binding specificity of 5 single - chain antibody was identified by ELISA and Western blot .

The light and heavy chain genes of the antibody were cloned into pAc - K - CH3 vector system . The whole antibody protein was expressed in baculovirus / insect cell expression system .

II . Identification of epitopes , affinity and functional activity of antibodies

In order to study the binding activity of monoclonal antibodies against human interferon - 偽1b , the results showed that the binding sites of the three antibodies ( AIFNal IgG1 , AIFN偽 , IgG3 ) and huIFN - 偽1b could not neutralize the antiviral activity of IFN - 偽1b . The results showed that the antibodies ( AIFNal IgG1 , AIFNal , and AIFNal IgG3 ) could not neutralize the antiviral activity of IFN - 偽1b .

III . Studies on the Interaction of Antibody - antigen

In order to study the interaction between antigen and antibody , we cloned pET30a and expressed human interferon protein huIFN - 偽1b in E . coli cells .

In conclusion , we have successfully obtained three monoclonal antibodies specific to human interferon alb from human - source all - synthetic antibody library by using phage surface display technology . One of them has been proved to be immune - regulated by in vitro experiments , and the structural relationship between interferon - 偽 , interferon - a receptor and interferon antibody is studied by molecular modeling and epitope map identification for the first time . The study provides a basis for studying the relationship between interferon - 偽 , interferon - a receptor and interferon antibody , which is of great significance to study the relationship between interferon structure and function .

【學位授予單位】：中國疾病預防控制中心
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R392

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 ;Measurement of scFv antibody affinity using non-competitive enzyme-linked immunosorbent assay[J];Journal of Nanjing Medical University;2005年02期

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本文編號：1813959