本文選題：肝X受體 + 膽固醇7α-羥化酶�。� 參考：《河北醫(yī)科大學》2008年博士論文

【摘要】： 肝X受體(liver X-activated receptor,LXR)是細胞核受體超家族的成員之一。有兩種亞型:LXRα和LXRβ。LXRα的表達具有組織特異性,它主要表達在肝臟、腸、腎和巨噬細胞,其中在肝臟表達最高,而LXRβ幾乎在所有組織中都有表達,其中在腦表達最高。LXRα和LXRβ兩個亞型具有相同的激活配體。內源性配體主要為膽固醇在體內代謝的衍生物氧化甾醇,如24(S)-羥膽固醇、22(R)-羥膽固醇、24(S)-25環(huán)氧膽固醇等;外源性人工合成配體有T0901317、GW3965等。作為轉錄因子,LXRα和LXRβ與配體結合激活后,與其下游基因上游特定的順式作用元件結合,上調相關基因的轉錄表達,在膽固醇的吸收、排出、轉化及脂肪酸的合成等多個方面發(fā)揮調節(jié)作用,如促進腦神經細胞內膽固醇向胞外轉運(ABCA1和ABCG1),促進外周組織的膽固醇向肝組織逆向轉運(ABCA1、ABCG1和apoE),促進肝膽固醇向膽汁酸的轉變(CYP7A1),增加肝膽固醇向膽汁中的直接排放(ABCG5和ABCG8),抑制小腸對膽固醇的吸收(ABCG5和ABCG8),增加組織脂肪酸的合成(SREBP1-c和FAS)等。 膽固醇在肝組織中轉化為膽汁酸是體內膽固醇排出體外的重要途徑。微粒體的膽固醇7α-羥化酶(cholesterol 7α-hydroxylase,CYP7A1)是途徑的限速酶,其活性和表達量受該途徑的主要調節(jié)者LXRα調解,決定了膽固醇向膽汁酸轉化的速度;過氧化物酶體的D-3-羥脂酰輔酶A脫水酶/D-3-羥脂酰輔酶A脫氫酶,簡稱D-雙功能蛋白(D-bifunctional protein, DBP),也是該途徑所必需的酶蛋白,它催化膽汁酸合成前體側鏈的縮短。然而,肝臟的LXRα上調靶基因CYP7A1的表達、增加膽汁酸合成時,膽汁酸合成所必須的酶蛋白DBP的表達如何改變,是否會隨膽汁酸合成增加而增強,未見報道。 大腦是一個富含膽固醇的器官。膽固醇在維持神經元細胞膜的流動性、通透性,提高動作電位沿神經元軸突傳導的速度,降低動作電位沿軸突傳導所需能量,維持髓鞘的絕緣特性,促進神經元突觸的形成并維持其結構的穩(wěn)定性等方面具有重要作用。HMG-CoA還原酶(HMG CoA R)是膽固醇合成的限速酶,催化腦組織的膽固醇原位合成;ATP結合盒轉運蛋白A1(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1)可將神經細胞內的膽固醇轉運至細胞外;膽固醇24S-羥化酶(choleterol-24S-hydroxylase,CYP46)催化膽固醇,生成24S-羥基膽固醇(24S-hydroxycholesterol)后,可通過血腦屏障出腦。LXRβ通過調節(jié)其下游基因ABCA1等的表達,調節(jié)腦膽固醇的含量。最近研究發(fā)現(xiàn),腦膽固醇與阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD)的發(fā)生發(fā)展關系密切。β-淀粉樣蛋白(β-amyloid peptide, Aβ)是AD發(fā)生發(fā)展的關鍵因素。增加細胞膽固醇水平,Aβ的生成、沉積增多;而降低細胞膽固醇合成或減少細胞膜膽固醇的含量,可減少神經元Aβ的生成。抑制在神經元中高表達的LXRβ,降低與膽固醇轉出相關蛋白的基因表達,改變膽固醇代謝狀態(tài)后,神經元Aβ生成相關基因的表達及其分泌量如何改變未見報道。 二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)是哺乳動物中樞神經系統(tǒng)膜磷脂的一種重要成分,在神經發(fā)育和功能方面具有重要作用。DHA合成的最后環(huán)節(jié)是經過過氧化物酶體β-氧化完成的,DBP參與了這一氧化過程。LXRβ除了在維持膽固醇代謝平衡中具有重要作用外,還可通過調控脂肪酸合成相關基因脂肪酸合成酶(fatty acid synthetase,FAS)、甾醇調節(jié)元件結合蛋白(sterol regulatory element binding protein 1c,SREBP1-c)的表達調節(jié)脂肪酸合成。抑制在神經元中高表達的LXRβ,降低與脂肪酸合成相關蛋白的基因表達,減少脂肪酸的合成后,參與DHA最后合成環(huán)節(jié)的酶蛋白的表達、DHA的量是否受到影響?有待研究。 本課題分三部分,分別從三個新的角度探討LXR在脂質代謝中的作用。第一部分用T0901317和高膽固醇分別激活C57BL/6J小鼠和Wistar大鼠肝臟的LXR,上調膽汁酸合成限速酶CYP7A1的表達,增加膽汁酸的合成后,觀察DBP的表達和活性改變。探討LXR上調肝臟膽汁酸的合成是否與DBP的表達增加有關。第二部分以原代培養(yǎng)的大鼠皮質神經元為研究對象,用反義核酸技術抑制LXRβ的表達,下調ABCA1、CYP46表達后,觀察膽固醇和Aβ的量,以及膽固醇合成、APP代謝相關的基因的表達變化。探討皮質神經元LXRβ在Aβ生成過程中的作用。第三部分以原代培養(yǎng)的大鼠皮質神經元為研究對象,采用反義核酸技術抑制LXRβ的表達,降低與脂肪酸合成相關蛋白的基因表達后,觀察過氧化物酶體脂肪酸β-氧化途徑中催化DHA合成的酶蛋白ACOX、DBP和SCPX的基因表達以及DHA量的變化。探討皮質神經元LXRβ在DHA生成過程中的作用。 第一部分LXR可通過上調DBP的表達增加膽汁酸合成 目的:激活C57BL/6J小鼠和Wistar大鼠肝臟的LXR,上調膽汁酸合成限速酶CYP7A1的表達,增加膽汁酸的合成后,觀察DBP的表達和活性改變。探討LXR上調肝臟膽汁酸的合成是否與DBP的表達增加有關。 方法: 20只8～10周齡成年雄性C57BL/6J小鼠隨機分為對照組(Con組)和激動劑組(T0組)。兩組均給予普通小鼠飼料。激動劑組用LXR激動劑T0901317灌胃(20 mg/kg/d),對照組只給予T0901317的溶解劑,連續(xù)灌胃7 d。灌胃第7天時,將小鼠單籠飼養(yǎng),收集24 h糞便,用于糞便膽汁酸測定。灌胃第8天,小鼠麻醉后,迅速取出肝臟,置液氮中,用于總RNA提取、DBP蛋白量及活性測定。 20只10周齡成年雄性Wistar大鼠隨機分為兩組。高膽固醇組(CH組)給以高膽固醇飼料(2%膽固醇,10%玉米油,88%標準飼料)喂養(yǎng);對照組(Con組)給以標準飼料喂養(yǎng)。飼養(yǎng)至第2周。尾靜脈取血,確認CH組血膽固醇(2.729±0.757 mmol/L)顯著高于Con組(1.426±0.257 mmol/L)后,麻醉大鼠,迅速取下肝臟,置液氮中,用于總RNA提取及DBP活性測定。處死大鼠前1 d單籠飼養(yǎng)收集24 h糞便,用于膽汁酸測定。 結果: 1膽汁酸水平(用全自動生化分析儀測定) C57BL/6J小鼠激動劑組和對照組的糞便膽汁酸量分別為1.323±0.277μmol/g、1.008±0.205μmol/g;Wistar大鼠高膽固醇組和對照組糞便膽汁酸量分別為5.539±1.710μmol/g、0.575±0.125μmol/g。激動劑組C57BL/6J小鼠和高膽固醇組大鼠的糞便膽汁酸量均高于各自的對照組(P_(小鼠)0.05,P_(大鼠)0.01),表明激活LXR后,膽汁酸生成增加。 2肝臟CYP7A1、DBP mRNA水平(用RT-PCR法測定) C57BL/6J小鼠激動劑組CYP7A1(0.764±0.067)和DBP(0.806±0.060)的mRNA水平均高于對照組CYP7A1(0.635±0.107)和DBP(0.671±0.049)的mRNA水平(P_(CYP7A1)0.05,P_(DBP)0.01); Wistar大鼠高膽固醇組CYP7A1(0.877±0.0664)和DBP(0.881±0.0482)的mRNA水平均高于對照組CYP7A1(0.473±0.0646)和DBP(0.721±0.0635)的mRNA水平(P0.01)。表明激活的LXR通過上調CYP7A1的表達,增加膽汁酸的合成時,DBP的mRNA表達上調。 3肝臟DBP活性的改變(用分光光度法測定) C57BL/6J小鼠激動劑組和對照組肝臟DBP活性分別為15±2.7 U/g pro、11.1±2.4 U/g pro,Wistar大鼠高膽固醇組和對照組肝臟DBP活性分別為11.563±1.911 U/g pro、8.811±2.52 U/g pro。激動劑組C57BL/6J小鼠和高膽固醇組大鼠肝臟的DBP活性均高于各自的對照組(P_(小鼠)0.01,P_(大鼠)0.05),表明激活的LXR通過上調CYP7A1的表達,增加膽汁酸的合成時,DBP的活性也增強。 4 C57BL/6J小鼠肝臟DBP蛋白量的改變(用Western Blotting法測定) 激動劑組C57BL/6J小鼠的DBP蛋白量(12±1.0)高于對照組(10.75±0.866, P 0.05),表明激活的LXR通過上調CYP7A1的表達,增加膽汁酸的合成時,DBP的酶蛋白水平增多。 5肝臟DBP與CYP7A1 mRNA水平的相關性(用SAS軟件進行統(tǒng)計學分析) 經直線相關分析,C57BL/6J小鼠肝臟DBP mRNA與CYP7A1 mRNA的表達量呈正相關(r=0.6555,P0.05);大鼠DBP mRNA與CYP7A1 mRNA的表達量也呈正相關(r=0.74, P0.05)。表明DBP隨CYP7A1表達的增加而增加。 小結: LXR增加膽汁酸的合成與DBP表達增強、活性升高有關。 第二部分LXRβ在皮質神經元Aβ生成過程中的作用 目的:用反義核酸抑制皮質神經元LXRβ的表達,改變膽固醇的代謝,觀察Aβ生成相關蛋白基因的表達以及Aβ生成量的變化。探討皮質神經元LXRβ在Aβ生成過程中的作用。 方法:將原代培養(yǎng)的大鼠皮質神經元隨機分為反義組(Anti組)、錯義組(Mis組)、對照組(Con組)。向每孔Anti組和Mis組神經元加入600μl含500pmol核酸、5μl脂質體的培養(yǎng)液,Con組加入只含有脂質體的培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)24h后,收集培養(yǎng)液及神經元。RT-PCR測定膽固醇代謝相關基因ABCA1、HMG CoA R、CYP46以及Aβ生成相關基因APP、BACE1、ADAM10的mRNA水平;Western blotting檢測ABCA1、HMG CoA R的蛋白水平;ELISA法測定細胞培養(yǎng)液的Aβ含量;試劑盒酶法測定細胞內外膽固醇含量。 結果: 1膽固醇代謝相關結果 1.1皮質神經元ABCA1mRNA相對表達量(RT-PCR法)和蛋白水平(Western Blotting法)的改變 Anti組、Con組和Mis組的ABCA1mRNA相對表達量分別為1.311±0.205、2.395±0.317、2.196±0.397。Anti組的ABCA1 mRNA相對表達量明顯低于Con組和Mis組(P0.01),Con組和Mis組之間的ABCA1 mRNA相對表達量差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。Anti組ABCA1的蛋白水平(9.55±2.5)明顯低于Con組(79.5±15)和Mis組(78.3±15,P0.05),但Con組和Mis組之間的ABCA1蛋白水平差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。表明抑制LXRβ表達后,參與細胞膽固醇外流的靶基因ABCA1表達下調。 1.2皮質神經元培養(yǎng)液膽固醇含量的改變(試劑盒酶法測定) Anti組、Con組和Mis組的培養(yǎng)液膽固醇含量分別為299.487±47.034 mmol/L、356.102±20.430 mmol/L、374.700±44.479 mmol/L。與Con組和Mis組相比,Anti組神經元培養(yǎng)液膽固醇含量降低有統(tǒng)計學意義(P0.05),Mis組和Con組相比,培養(yǎng)液膽固醇含量差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。表明抑制LXRβ表達后,ABCA1表達下調,神經元膽固醇向外排出減少,導致培養(yǎng)液膽固醇含量降低。 1.3皮質神經元內膽固醇含量的改變(試劑盒酶法測定) Anti組、Con組和Mis組的神經元內膽固醇含量分別為0.622±0.052 mmol/μg、0.875±0.082 mmol/μg、0.879±0.209 mmol/μg。與Con組和Mis組相比,Anti組神經元內膽固醇含量降低有統(tǒng)計學意義(P0.01)。Mis組和Con組相比,神經元內膽固醇含量差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。表明抑制LXRβ表達后,神經元內膽固醇含量降低。 1.4皮質神經元HMG CoA R mRNA相對表達量(RT-PCR法)和蛋白水平(Western Blotting法)的改變 Anti組HMG CoA R mRNA相對表達量(0.603±0.108)明顯低于Con組(0.849±0.201)和Mis組(0.888±0.153,P0.05),Con組和Mis組之間的HMG CoA R mRNA相對表達量差異無統(tǒng)計學意義(P0.05);Anti組HMG CoA R的蛋白水平(0.840±0.162)明顯低于Con組(1.371±0.096)和Mis組(1.513±0.164,P0.01),但Con組和Mis組之間的HMG CoA R蛋白水平差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。表明抑制神經元LXRβ表達后,膽固醇合成的限速酶HMG CoA R的轉錄和翻譯水平均降低,膽固醇合成降低,導致膽固醇含量降低。 1.5皮質神經元CYP46 mRNA相對表達量的改變(用RT-PCR法測定) Anti組、Con組和Mis組的CYP46 mRNA相對表達量分別為0.637±0.063、1.025±0.175、1.050±0.182。Anti組的CYP46 mRNA相對表達量明顯低于Con組和Mis組(P0.01),Con組和Mis組之間的CYP46 mRNA相對表達量無差別(P0.05)。表明抑制LXRβ表達后,介導CNS膽固醇向外周轉運的CYP46表達下調。 2 Aβ生成相關結果 2.1皮質神經元APP mRNA相對表達量的改變(用RT-PCR法測定) Anti組的APP_(695)和APP_(751+770) mRNA相對表達量分別為0.642±0.114、0.392±0.072,Con組的APP_(695)和APP_(751+770) mRNA相對表達量分別為0.663±0.072、0.727±0.164,Mis組的APP_(695)和APP_(751+770) mRNA相對表達量分別為0.575±0.088、0.841±0.161。Anti組、Con組和Mis組三組之間的APP_(695) mRNA相對表達量差異無統(tǒng)計學意義(P0.05);Anti組的APP_(751+770) mRNA相對表達量明顯低于Con組和Mis組(P0.01),但Con組和Mis組之間的APP_(751+770) mRNA相對表達量差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。表明抑制LXRβ表達后,Aβ前體APP的表達下調。2.2 APP代謝關鍵酶蛋白BACE1、ADAM10 mRNA相對表達量的改變(用RT-PCR法測定) Anti組的BACE1和ADAM10 mRNA相對表達量分別為0.534±0.098、0.471±0.051,Con組的BACE1和ADAM10 mRNA相對表達量分別為0.876±0.095、0.870±0.124,Mis組的BACE1和ADAM10 mRNA相對表達量分別為0.819±0.105、0.862±0.119。Anti組的BACE1和ADAM10 mRNA相對表達量明顯低于Con組和Mis組(P0.01),Con組和Mis組之間的BACE1和ADAM10 mRNA相對表達量差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。表明抑制神經元LXRβ表達后,APP的α-分泌酶裂解途徑和β-分泌酶裂解途徑表達均下調。 2.3皮質神經元培養(yǎng)液Aβ含量的改變(用ELISA法測定) Anti組、Con組和Mis組培養(yǎng)液Aβ含量分別為101.140±16.057 pg/ml、157.189±32.603 pg/ml、145.724±37.743 pg/ml。Anti組的培養(yǎng)液Aβ含量明顯低于Con組和Mis組(P0.01),Con組和Mis組相比差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。表明抑制LXRβ表達后,不僅Aβ前體APP和β-分泌酶的轉錄水平降低,神經元Aβ生成量也減少。 小結: 1皮質神經元LXRβ可影響APP代謝途徑相關基因的表達,進而影響Aβ的生成。 2皮質神經元LXRβ可影響其非下游基因的表達,影響膽固醇的生成量。 第三部分LXRβ在皮質神經元DHA生成過程中的作用 目的:采用反義核酸技術抑制大鼠皮質神經元LXRβ的表達,下調脂肪酸合成相關基因的表達。觀察DHA的最后合成環(huán)節(jié)中相關酶蛋白基因的表達以及DHA量的變化。探討皮質神經元LXRβ在DHA生成過程中的作用 方法:將原代培養(yǎng)的大鼠皮質神經元隨機分為反義組(Anti組)、錯義組(Mis組)、對照組(Con組)。向每孔Anti組和Mis組神經元加入600μl含500pmol核酸、5μl脂質體的培養(yǎng)液,Con組加入只含有脂質體的培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,收集神經元。RT-PCR測定FAS、SREBP1-c、PPARα、ACOX1、ACOX3、DBP、SCPx、LBP mRNA水平,氣相色譜法檢測神經元內DHA含量。 結果: 1皮質神經元FAS和SREBP1-c mRNA相對表達量的改變(用RT-PCR法測定) Anti組的FAS和SREBP1-cmRNA相對表達量分別為0.531±0.034和0.547±0.130,Con組的FAS和SREBP1-c mRNA相對表達量分別為0.701±0.105和1.031±0.163,Mis組的FAS和SREBP1-c mRNA相對表達量分別為0.681±0.126和1.118±0.204。Anti組的FAS和SREBP1-c mRNA相對表達量明顯低于Con組和Mis組(P0.01),Con組和Mis組之間的FAS和SREBP1-c mRNA相對表達量差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。表明抑制LXRβ表達后,參與脂肪酸合成的FAS和SREBP1-c表達下調。 2皮質神經元ACOX1、DBP和SCPx mRNA相對表達量的改變(用RT-PCR法測定) Anti組的ACOX1 mRNA相對表達量為0.798±0.145,但在相同實驗條件下未能檢測到Anti組的DBP和SCPx mRNA相對表達量;Con組的ACOX1、DBP和SCPx mRNA相對表達量分別為1.332±0.217、0.560±0.114、0.599±0.077;Mis組的ACOX1、DBP和SCPx mRNA相對表達量分別為1.447±0.130、0.477±0.094、0.615±0.183;Anti組的ACOX1、DBP和SCPx mRNA相對表達量低于Con組和Mis組(P0.05),Con組和Mis組之間的ACOX1、DBP和SCPx mRNA相對表達量差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。表明抑制LXRβ表達后,參與DHA合成的過氧化物酶體直鏈極長鏈脂肪酸β-氧化相關酶蛋白ACOX1、DBP和SCPx表達下調。 3皮質神經元DHA含量(%)的改變(用氣相色譜測定) 以DHA占總脂肪酸量的百分比(%)表示神經元內DHA的含量。Anti組的DHA量為3.989±1.193;Con組的DHA量為6.195±1.273;Mis組的DHA量為6.55±0.644。Anti組的DHA量明顯低于Con組和Mis組(P0.05)。Con組和Mis組之間的DHA量差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。表明抑制皮質神經元LXRβ表達后,催化DHA合成的ACOX1、DBP和SCPx轉錄減少,進而DHA的生成量減少。 4皮質神經元PPARα、ACOX3和LBPmRNA相對表達量的改變(用RT-PCR法測定) 在相同實驗條件下未能檢測到Anti組PPARαmRNA的相對表達量, ACOX3和LBP mRNA的相對表達量分別為0.341±0.069、0.235±0.025;Con組的PPARα、ACOX3、LBP mRNA相對表達量分別為0.806±0.157、0.563±0.142、0.210±0.038;Mis組的PPARα、ACOX3、LBP mRNA相對表達量分別為0.692±0.117、0.623±0.094、0.207±0.043;Anti組的PPARα和ACOX3 mRNA相對表達量明顯低于Con組和Mis組(P0.05),Con組和Mis組之間的PPARα和ACOX3mRNA相對表達量差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。Anti組、Con組和Mis組三組之間的LBP mRNA相對表達量差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。表明抑制LXRβ表達后,參與過氧化物酶體脂肪酸β-氧化的PPARα和ACOX3的mRNA表達明顯下調,但LBP的表達卻未受影響。 小結: 1神經元LXRβ可影響DHA最后合成環(huán)節(jié)中DBP等蛋白的基因轉錄,進而影響DHA的生成。 2神經元LXRβ可影響過氧化物酶體脂肪酸氧化相關酶蛋白基因的轉錄。 結論 1 LXR增加膽汁酸的合成與DBP表達增強、活性升高有關。 2神經元LXRβ對維持神經元膽固醇代謝平衡有重要意義;抑制神經元LXRβ的表達,可降低Aβ和DHA生成過程中涉及APP代謝以及過氧化物酶體脂肪酸氧化相關基因的表達。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R341

【引證文獻】

相關期刊論文 前1條

1 屠迪;鄔靜;袁莉蕓;文利新;薛立群;;矢車菊素上調CYP7A1表達促進脂肪變性L02細胞內膽固醇降解[J];中國獸醫(yī)學報;2012年11期

相關博士學位論文 前1條

1 屠迪;矢車菊素在體外對肝細胞脂代謝的影響[D];湖南農業(yè)大學;2012年

相關碩士學位論文 前2條

1 趙靜;篤斯越桔花色苷降血脂功能的研究[D];東北林業(yè)大學;2011年

2 李勤;二郎山山地雞LXRα、ChREBP及FAS基因在不同飼養(yǎng)方式下的表達研究[D];四川農業(yè)大學;2012年

，

本文編號：1809427