本文選題：VSIG4 + 單克隆抗體��； 參考：《蘇州大學(xué)》2009年博士論文

【摘要】： VSIG4,又稱作CRIg,是一種I型跨膜分子,屬于免疫球蛋白超家族成員,含有典型的B7家族的特征。其最先是作為免疫球蛋白超家族的Z39Ig基因被克隆出來,序列一致性的程度和在染色體的定位證實Z39Ig即為人VSIG4。VSIG4分子和許多免疫球蛋白家族成員一樣有胞外的典型的Ig樣區(qū),人VSIG4存在兩種變異體形式,一種是VSIG4L,編碼區(qū)全長1200bp,胞外區(qū)編碼IgV和IgC兩個結(jié)構(gòu)域;另一種為VSIG4S,其編碼區(qū)全長918bp,胞外區(qū)只編碼IgV結(jié)構(gòu)域,其它區(qū)域則與VSIG4L完全相同,即僅較VSIG4L僅缺少了IgC的編碼區(qū)。人VSIG4L即為Z39Ig。鼠VSIG4分子僅有一種形式,結(jié)構(gòu)和人VSIG4S一樣,均缺乏胞外區(qū)的IgC結(jié)構(gòu)域。人和鼠的VSIG4基因都位于X染色體上hephaestin和moesin基因編碼區(qū)之間q12上。VSIG4的mRNA主要表達在胎盤、胎兒組織及成人的肝、肺等組織,其分子主要表達在由單核細胞來源的巨噬細胞上,而在單核細胞中幾乎沒有表達,同時在炎癥部位的巨噬細胞,或活化后的巨噬細胞上VSIG4則呈現(xiàn)表達下降的趨勢。在外周血中B細胞、T細胞、NK細胞及粒細胞均檢測不到VSIG4的表達。先前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)VSIG4是一種新發(fā)現(xiàn)的巨噬細胞上的補體受體,可結(jié)合補體C3的降解片段C3b和iC3b,對于病原體的吞噬其重要作用。而近來有研究發(fā)現(xiàn)VSIG4還是一種新的B7家族相關(guān)分子,并證實了VSIG4有抑制T細胞活化的作用。由于人VSIG4是新認識的分子,且對于其在T細胞免疫調(diào)節(jié)方面的相關(guān)研究材料很少,為了對該分子進行深入研究其生物學(xué)效應(yīng)及作用機制。本研究旨在分別克隆人VSIG4基因兩種不同變異體(VSIG4L和VSIG4S),并建立VSIG4的基因轉(zhuǎn)染細胞株、制備VSIG4-Fc融合蛋白、且以VSIG4的基因轉(zhuǎn)染細胞株作為免疫原免疫小鼠,研制獲取鼠抗人VSIG4單克隆抗體,并以表達人VSIG4分子的基因轉(zhuǎn)染細胞、VSIG4-Fc融合蛋白及抗人VSIG4單抗等為手段,研究揭示人VSIG4分子的生物學(xué)特性及其對T細胞共抑制作用的效應(yīng)與方式。 第一部分人VSIG4基因的克隆、基因轉(zhuǎn)染細胞株的建立及其生物學(xué)功能的初步研究 【目的】克隆人VSIG4基因編碼區(qū)全長基因,分別構(gòu)建含有人VSIG4基因兩種不同變異體(VSIG4L和VSIG4S)的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,獲得穩(wěn)定表達VSIG4L和VSIG4S基因的細胞并初步研究其對T細胞的共刺激作用。 【方法】從人正常肺cDNA文庫中擴增出VSIG4L和VSIG4S的全長基因,并分別克隆入T載體中,雙酶切后裝入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pEGZ Term中,與輔助病毒載體用脂質(zhì)體法共轉(zhuǎn)染包裝細胞293T制備含有重組病毒的培養(yǎng)上清,以其培養(yǎng)上清感染L929細胞72h后,經(jīng)Zeocin篩選出穩(wěn)定表達VSIG4L或VSIG4S分子的L929細胞株及293T細胞株;采用RT-PCR、Western-blot和流式細胞儀等分析鑒定VSIG4分子的表達;采用MTT和ELISA初步觀察VSIG4基因轉(zhuǎn)染細胞對T細胞增殖及IL-2分泌的影響。 【結(jié)果】成功克隆出VSIG4L和VSIG4S全長基因,構(gòu)建了含人VSIG4L基因和VSIG4S基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,并獲得含有VSIG4L基因和VSIG4S基因的重組病毒,篩選并鑒定獲得能穩(wěn)定高表達人VSIG4L和VSIG4S膜型分子的L929及293T的轉(zhuǎn)基因細胞;初步檢測該轉(zhuǎn)基因細胞具有體外抑制T細胞增殖和IL-2分泌的作用。 【結(jié)論】成功建立了可穩(wěn)定高表達人VSIG4L和VSIG4S膜型分子的基因轉(zhuǎn)染細胞,為研制抗人VSIG4單克隆抗體提供了有效的免疫原,也為進一步研究VSIG4分子對T細胞抑制作用提供了實驗材料。 第二部分人VSIG4-Fc融合蛋白的制備、純化 【目的】獲取穩(wěn)定表達人VSIG4L-Fc和VSIG4S-Fc融合蛋白基因轉(zhuǎn)染細胞株并制備純化其融合蛋白 【方法】采用PCR法從pMD19-T-VSIG4L和pMD19-T-VSIG4S中擴增出人VSIG4L和VSIG4S基因的胞外段序列,從pMD18-T-hIgG1Fc中擴增出人IgG1 Fc恒定區(qū)序列,將VSIG4和Fc順次連接插入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pEGZ-Term,用脂質(zhì)體法與兩個輔助病毒載體共轉(zhuǎn)染293T包裝細胞,用含病毒顆粒的培養(yǎng)上清反復(fù)感染CHO細胞,以Zeocin篩選,流式細胞術(shù)測定GFP報告基因表達,獲取能穩(wěn)定分泌人VSIG4-Fc蛋白的基因轉(zhuǎn)染細胞,并以RT-PCR和Dot-blot分析融合蛋白表達情況�；蜣D(zhuǎn)染細胞經(jīng)無血清培養(yǎng)后,收集的上清經(jīng)超濾濃縮后以Protein G柱純化,再經(jīng)Western blot鑒定其抗原結(jié)合特異性。以流式細胞技術(shù)測定融合蛋白和人T細胞的結(jié)合情況。 【結(jié)果】成功構(gòu)建了pEGZ-Term-VSIG4L-Fc及pEGZ-Term-VSIG4S-Fc重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,并篩選獲得了能穩(wěn)定分泌VSIG4L-Fc及VSIG4S-Fc蛋白的CHO基因轉(zhuǎn)染細胞株;流式細胞術(shù)顯示GFP報告基因得到了較高的穩(wěn)定表達,RT-PCR和Dot-blot分析可分別檢測出擴增的VSIG4 ECD和HuFc特異性片段和所分泌的目的蛋白。Western blot鑒定了純化得到的VSIG4L-Fc及VSIG4S-Fc融合蛋白,且純化后的融合蛋白能夠與T細胞表面的未知受體結(jié)合。 【結(jié)論】建立了可穩(wěn)定表達人VSIG4L-Fc和VSIG4S-Fc融合蛋白的基因轉(zhuǎn)染細胞CHO/VSIG4L-Fc及CHO/VSIG4S-Fc細胞,并純化得到它們的融合蛋白,為進一步研究VSIG4分子對T細胞抑制作用提供了實驗基礎(chǔ)。 第三部分鼠抗人VSIG4單克隆抗體的研制及其生物學(xué)特性的研究 【目的】研制鼠抗人VSIG4單克隆抗體,為探討人VSIG4分子的表達特性及其介導(dǎo)的負性信號對人T淋巴細胞抑制作用的效應(yīng)與方式提供必備的物質(zhì)手段。 【方法】以高表達人VSIG4L分子的基因轉(zhuǎn)染細胞L929/VSIG4L為免疫原,常規(guī)免疫BALB/c小鼠,利用B淋巴雜交瘤技術(shù),將免疫小鼠脾臟細胞和骨髓瘤細胞株SP2/0融合,以VSIG4L和VSIG4S的基因轉(zhuǎn)染細胞為抗原篩選陽性細胞;經(jīng)間接免疫熒光標記和流式細胞術(shù)分析、反復(fù)篩選和多次克隆化培養(yǎng),獲得特異分泌鼠抗人VSIG4分子單克隆抗體的雜交瘤細胞株;采用細胞核染色體計數(shù)、Ig亞型快速定性試紙法、競爭結(jié)合抑制以及Western blot等試驗,對獲得的雜交瘤細胞株及單克隆抗體進行生物學(xué)特性的鑒定;用間接免疫熒光法初步分析單抗對不同來源人腫瘤細胞株及巨噬細胞的結(jié)合反應(yīng)。 【結(jié)果】成功獲得3株持續(xù)、穩(wěn)定分泌鼠抗人VSIG4單克隆抗體的雜交瘤細胞株,分別命名為2H4、9A7和9D5。經(jīng)過快速定性試紙分析顯示,3株單抗輕鏈均為κ鏈,重鏈均為IgG1亞類;間接免疫熒光標記和流式細胞術(shù)分析單抗2H4和9A7均可以和VSIG4L和VSIG4S結(jié)合,9D5僅能和VSIG4L結(jié)合,Western blot顯示9A7均可以和VSIG4L和VSIG4S結(jié)合,9D5僅能和VSIG4L結(jié)合,2H4均未見特異性陽性條帶。競爭結(jié)合抑制實驗顯示3株抗體間均不產(chǎn)生競爭作用。對mAb生物學(xué)特性的研究結(jié)果表明,3株mAb均能識別巨噬細胞以及Jurkat、THP-1、H446等腫瘤細胞株表面的VSIG4分子。 【結(jié)論】成功獲得3株穩(wěn)定分泌特異性鼠抗人VSIG4單抗的雜交瘤細胞株,且它們識別不同的抗原表位,為揭示VSIG4分子的表達特性、深入探討VSIG4對T細胞抑制的調(diào)節(jié)作用及信號機制提供了必要的物質(zhì)手段。 第四部分人VSIG4分子對T細胞的共刺激效應(yīng)的研究 【目的】利用研制獲得的人VSIG4基因轉(zhuǎn)染細胞、融合蛋白及抗人VSIG4單克隆抗體等為手段,探討人VSIG4分子對T淋巴細胞共抑制作用的方式與效應(yīng)。 【方法】免疫磁珠分離純化T細胞及CD4+、CD8+ T細胞作為效應(yīng)細胞,以抗CD3激發(fā)型單抗刺激,聯(lián)合或不聯(lián)合抗人CD28單抗,從而模擬提供T細胞活化信號,同時采用表達膜型VSIG4L和VSIG4S分子的基因轉(zhuǎn)染細胞、VSIG4L-Fc和VSIG4S-Fc融合蛋白及鼠抗人VSIG4單克隆抗體等,通過流式細胞術(shù)、MTT法和ELISA等方法分別測定或分析它們對T淋巴細胞活化、增殖及IL-2產(chǎn)生的抑制作用。 【結(jié)果】 1.以VSIG4L-Fc和VSIG4S-Fc為干預(yù)因素,它們對T細胞的增殖均較對照組有抑制作用(P0.05),且與PD-L1-Fc抑制T細胞增殖效果相仿(P0.05);在不同活化信號刺激下,VSIG4L-Fc和VSIG4S-Fc也均能抑制T細胞的增殖。且VSIG4L-Fc和VSIG4S-Fc間均沒有明顯統(tǒng)計學(xué)差異。 2.以表達膜型VSIG4L和VSIG4S分子的基因轉(zhuǎn)染細胞為干預(yù)因素,它們對CD4+、CD8+ T細胞及總T細胞的增殖均較對照組有明顯抑制作用;對CD4+ T細胞IL-2的分泌也均有明顯抑制作用;VSIG4L和VSIG4S的基因轉(zhuǎn)染細胞間沒有明顯統(tǒng)計學(xué)差異。 3.以抗CD3單抗激發(fā)T細胞增殖,以VSIG4基因轉(zhuǎn)染細胞進行抑制,加入單抗2H4、9A7和9D5觀察它們對其的阻斷效應(yīng),MTT檢測結(jié)果顯示,單抗9A7能一定程度地阻斷VSIG4L和VSIG4S介導(dǎo)的對T細胞的抑制作用,但2H4和9D5的阻斷效應(yīng)與IgG對照組沒有統(tǒng)計學(xué)差異。 4.用抗CD3單抗刺激T細胞增殖,VSIG4L-Fc阻斷T細胞增殖,在加入不同濃度的外源人IL-2后,發(fā)現(xiàn)T細胞增殖明顯增強,VSIG4L-Fc對T細胞的抑制作用近乎消失,并且在不同濃度的VSIG4L-Fc抑制時,其效果亦是如此。 【結(jié)論】VSIG4分子可以明顯抑制T細胞增殖和IL-2的分泌,且其VSIG4L和VSIG4S對T細胞抑制效應(yīng)相仿,單抗9A7可以一定程度阻斷此效應(yīng),并且這種抑制效應(yīng)可以被外源的IL-2消除。
[Abstract]:VSIG4 ( VSIG4 ) is a novel molecule of B7 family .


Cloning of the first partial human VSIG4 gene , establishment of a gene - transfected cell line and preliminary study of its biological function


Objective To construct a recombinant retroviral vector containing two variants of VSIG4 ( VSIG4L and VSIG4S ) in human VSIG4 gene coding region , and to obtain the cells stably expressing VSIG4L and VSIG4S genes and to investigate their co - stimulatory effect on T cells .


銆愭柟娉曘，

本文編號：1806606