本文選題：脂肪間充質(zhì)干細胞 + 三維培養(yǎng)　； 參考：《暨南大學(xué)》2008年碩士論文

【摘要】： 目的:1.從供體年齡、取材部位、提取方法三方面來探索穩(wěn)定的脂肪間充質(zhì)干細胞(ADMSCs)分離提取方法。2.在三維培養(yǎng)體系中探索ADMSCs向軟骨細胞定向誘導(dǎo)分化的適宜條件。 方法: 一.ADMSCs分離提取方法的研究 采用酶消化法分離培養(yǎng)原代兔ADMSCs,單層傳代培養(yǎng)擴增。 1.細胞爬片免疫熒光檢測干細胞標志分子CD44、CD105的表達,進行表型鑒定。 2.相差顯微鏡動態(tài)觀察細胞形態(tài);臺盼藍染色觀察細胞活性;細胞計數(shù)法檢測細胞生長動力學(xué)參數(shù);流式細胞儀檢測細胞周期。 3.比較不同的供體年齡、取材部位、提取方法所獲取的細胞產(chǎn)量和活性的差別。 二.ADMSCs在三維培養(yǎng)體系中向軟骨細胞定向誘導(dǎo)分化的研究 分別以離心管成團培養(yǎng)和藻酸鹽凝膠懸浮培養(yǎng)兩種三維體系體外培養(yǎng)細胞,分別加入誘導(dǎo)培養(yǎng)液和普通培養(yǎng)液,培養(yǎng)第7、14、21天收集樣本。 1.HE染色,觀察新生軟骨組織形態(tài)。 2.免疫熒光檢測Ⅱ型膠原表達。 3.羥脯氨酸法與阿新藍(Alcian Blue)法測定細胞外基質(zhì)中膠原與蛋白聚糖的含量。 4.實時定量PCR從基因水平檢測新生組織中軟骨細胞特征性蛋白Ⅱ型膠原與蛋白聚糖的表達水平。 結(jié)果: 一.分離、鑒定結(jié)果 1.多次消化收集法提取AMDSCs,產(chǎn)量高、活性良好、效果穩(wěn)定。不同年齡的供體以及同一供體不同取材部位的脂肪組織中所提取的ADMSCs的生物學(xué)性質(zhì)無差別,但是選擇壯年兔以及脂肪組織豐富、成分單一的肌間隙、腹股溝部位取材,可以提高提取率。 2.免疫熒光顯示,絕大多數(shù)的細胞都表現(xiàn)為CD44和CD105陽性。證實了分離細胞純度較好。生長曲線顯示隨代次的增加細胞增殖速度未見減慢。 二.體外三維培養(yǎng)誘導(dǎo)檢測結(jié)果 1.兩種體系中均形成了具有一定硬度的白色塊狀組織,HE染色顯示,具有明顯層次和分化區(qū)帶的軟骨組織特有形態(tài)。 2.免疫熒光結(jié)果顯示實驗組第14、21天樣本中有Ⅱ型膠原表達,實驗組第7天樣本和對照組全部樣本呈陰性表達。 羥脯氨酸法、阿新蘭法結(jié)果顯示,Ⅱ型膠原與蛋白聚糖在實驗組的表達量第7、14、 21天樣本的表達量均呈上升趨勢,對照組趨勢不明顯。 實時定量PCR結(jié)果顯示,隨著時間延長,兩種培養(yǎng)體系實驗組各樣本的Ⅱ型膠原與蛋白聚糖基因表達水平均呈上升趨勢,并且在各時間點成團培養(yǎng)體系中基因的表達水平高于凝膠懸浮培養(yǎng)體系。 結(jié)論:1.從成年個體、脂肪組織豐富、成分單一的部位取材,并采用多次消化收集法提取,可以提高AMDSCs提取效率,并保持良好的細胞活性。2.兩種三維培養(yǎng)體系中培養(yǎng)的ADMSCs,在誘導(dǎo)劑的作用下均能向軟骨細胞分化,表達軟骨細胞特征性蛋白。3.與細胞密度相對較低的藻酸鹽培養(yǎng)體系相比,高密度的成團培養(yǎng)體系可以提高誘導(dǎo)后細胞的特征性蛋白Ⅱ型膠原與蛋白聚糖的表達水平,即促進ADMSCs向軟骨細胞的定向分化。
[Abstract]:Objective: 1. to explore the stable.2. separation and extraction method of ADMSCs from the donor age, the location of the material and the extraction method, and to explore the suitable conditions for the directional differentiation of ADMSCs into the chondrocytes in the three-dimensional culture system.
Method:
Study on the separation and extraction method of a.ADMSCs
The primary rabbit ADMSCs was isolated by enzyme digestion. The monolayer was passaged and amplified.
1. cell crawling immunofluorescence was used to detect the expression of stem cell marker CD44 and CD105, and phenotypic identification was performed.
Cell morphology was observed dynamically by 2. phase contrast microscope, cell activity was observed by trypan blue staining, cell growth kinetics parameters were detected by cell count method, and cell cycle was detected by flow cytometry.
3. compare the different donor age, location, and the difference in cell yield and activity obtained by the extraction method.
Differentiation of two.ADMSCs into chondrocytes in three dimensional culture system
Two three dimensional systems were cultured in vitro by centrifuge tube formation and alginate gel suspension culture. The cultured cells were added to the induction culture medium and ordinary medium respectively, and the samples were collected on day 7,14,21.
1.HE staining was used to observe the tissue morphology of newborn cartilage.
2. the expression of type II collagen was detected by immunofluorescence.
The content of collagen and proteoglycan in extracellular matrix was determined by 3. hydroxyproline method and Alcian Blue method.
4. real-time quantitative PCR was used to detect the expression level of characteristic protein type II collagen and proteoglycan in chondrocytes from the gene level.
Result:
1. Separation and identification results
1. multiple digestion and collection methods were used to extract AMDSCs, with high yield, good activity and stable effect. There was no difference in the biological properties of ADMSCs extracted from the donor and the same donor site of the same donor and the same donor site. Extraction rate.
2. immunofluorescence showed that most of the cells were CD44 and CD105 positive. The purity of the isolated cells was better. The growth curve showed that the proliferation rate of cells did not slow down with the increase of generation.
Two. The results of in vitro three-dimensional culture induction
1. in two systems, white patches with a certain degree of hardness were formed. HE staining showed the unique morphology of cartilage tissue with obvious stratified and differentiated zones.
2. immunofluorescence results showed that type 2 collagen was expressed in the samples on day 14,21 of the experimental group, while negative expression was found in all the samples of the seventh day and the control group.
The results showed that the expression of type II collagen and proteoglycan in the experimental group was 7,14.
The expression level of the 21 day samples showed an upward trend, and the trend of the control group was not obvious.
The results of real time quantitative PCR showed that the expression level of type II collagen and proteoglycan gene in each sample of the two culture systems increased with time, and the expression level of the gene in the system was higher than that in the gel suspension culture system at all time points.
Conclusion: 1. from adult individuals, rich in fat tissue, single component parts and multiple digestion and collection can improve the efficiency of AMDSCs extraction and maintain good cell activity in the two three dimensional culture system of ADMSCs, which can differentiate into chondrocytes under the action of inducer and express the characteristic egg of cartilage cells. Compared with the low cell density of the alginate culture system, white.3. can increase the expression level of the characteristic protein type II collagen and proteoglycan in the induced cells, that is, to promote the directional differentiation of ADMSCs to cartilage cells.

【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R329

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本文編號：1803509