本文選題：人脂肪基質(zhì)細(xì)胞 + 生長分化因子-5��； 參考：《中國人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院》2010年博士論文

【摘要】： 外傷、腫瘤切除、先天畸形造成的頜骨缺損在臨床較常見,目前常采用自體骨移植、異體骨移植、異種骨移植、金屬及人工合成材料替代等治療方法,尚不能完全滿足臨床的需要。組織工程技術(shù)的發(fā)展為頜骨缺損的修復(fù)提供了新的途徑。種子細(xì)胞,生長因子和支架材料是組織工程的三大要素。近年來研究發(fā)現(xiàn)脂肪組織中存在一些具有自我更新和多向分化潛能的脂肪基質(zhì)細(xì)胞(adipose derived stromal cells, ADSCs),這些細(xì)胞在一定條件下可分化為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等多種細(xì)胞,具有成骨、成脂、成軟骨、成肌肉、成神經(jīng)等多種潛能。而且脂肪組織還具有取材簡便、來源豐富等優(yōu)勢,被認(rèn)為是組織工程中最有前途的種子細(xì)胞。其中,ADSCs用于骨缺損的修復(fù)倍受關(guān)注。生長因子在ADSCs成骨分化中起關(guān)鍵作用。常用的骨生長因子有骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic proteins 2, BMP2),骨形態(tài)發(fā)生蛋白7(bone morphogenetic proteins 7, BMP7),生長分化因子5(Growth differentiation factor 5, GDF-5),轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β),血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor, PDGF),胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor, IGF)等。GDF-5是轉(zhuǎn)化生長因子超家族、骨形態(tài)發(fā)生蛋白亞家族中的一員,在軟骨發(fā)生和長骨發(fā)育中具有重要作用。目前研究主要集中于其促進(jìn)軟骨分化和形成,對于其促進(jìn)成骨分化和骨形成的作用,國內(nèi)外的研究較少。因此本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用GDF-5誘導(dǎo)hADSCs向成骨細(xì)胞分化,并將誘導(dǎo)后的細(xì)胞復(fù)合納米羥基磷灰石／膠原／L-聚乳酸(nHAC/PLA)支架植入裸鼠體內(nèi),構(gòu)建組織工程骨三維培養(yǎng)模型,并通過體內(nèi)體外研究觀察成骨情況,為其將來在頜骨組織工程中的應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 全文共分為三部分： 第一部分：hADSCs分離、培養(yǎng)及生物學(xué)特性研究 目的：研究hADSCs的生長特性、表面抗原特點(diǎn),橫向分化潛能,在此基礎(chǔ)上對其進(jìn)行鑒定。 方法：取健康人吸脂術(shù)中取出的新鮮脂肪組織,膠原酶消化法分離其中脂肪基質(zhì)細(xì)胞,倒置相差顯微鏡觀察其形態(tài)特征；MTT法測hADSCs的生長增殖狀況；流式細(xì)胞儀分析其表面抗原；波形絲蛋白、角蛋白免疫熒光染色鑒定其來源；在細(xì)胞鑒定基礎(chǔ)上礦化液誘導(dǎo)其向成骨細(xì)胞分化,通過堿性磷酸酶染色、OPN及Ⅰ型膠原免疫熒光染色、鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色分析其成骨分化潛能；同時(shí),采用成脂誘導(dǎo)液誘導(dǎo)其向脂肪細(xì)胞方向分化,油紅0染色進(jìn)行成脂分化鑒定。 結(jié)果：原代及傳代培養(yǎng)的hADSCs形態(tài)均勻,呈類成纖維細(xì)胞樣形態(tài),生長能力旺盛；P3、P5、P10代hADSCs的增殖曲線大致相同,呈近似“S”形；P2代hADSCs表達(dá)CD29、CD44、CD105等間充質(zhì)細(xì)胞表面相對特異性標(biāo)志蛋白,CD14、CD45陰性表達(dá)；P4代hADSCs免疫熒光染色波形絲蛋白陽性,角蛋白為陰性。成骨誘導(dǎo)21d后,堿磷酶染色、OPN、Ⅰ型膠原免疫熒光染色陽性,鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色表現(xiàn)為紅色結(jié)節(jié)。成脂誘導(dǎo)14d后油紅0染色有紅色著色的脂滴形成。 結(jié)論：吸脂術(shù)來源的細(xì)胞具有未分化hADSCs的特征,在體外誘導(dǎo)條件下,可向成骨、成脂方向分化,具有橫向分化潛能。 第二部分：GDF-5誘導(dǎo)hADSCs成骨分化作用的體外研究 目的：研究GDF-5對hADSCs體外成骨分化能力的影響。 方法：將GDF-5分成0,1,10,100,500ng／ml 5個(gè)濃度,通過MTT法分析不同濃度GDF-5對hADSCs增殖的影響,通過堿性磷酸酶活性、茜素紅染色檢測GDF-5對其成骨分化能力的影響,確定GDF-5促進(jìn)成骨的最適濃度。然后取所確定的GDF-5濃度,分成對照組、礦化組、GDF-5三組,通過測定RT-PCR檢測成骨誘導(dǎo)后Runx2、OPN、ColI、VEGF基因的表達(dá)；Western Blot檢測其成骨誘導(dǎo)后Runx2、OPN、ColI、VEGF蛋白的表達(dá),分析該濃度GDF-5對P4代hADSCs的增殖、分化效應(yīng)。 結(jié)果：100ng／ml為GDF-5促進(jìn)hADSCs成骨的最適濃度；三組培養(yǎng)基均能促進(jìn)hADSCs增殖,但GDF-5組促增殖作用顯著低于另兩組(P0.05)；GDF-5組促成骨分化作用最為顯著,堿磷酶活性,Runx2、OPN、colI、VEGF基因及蛋白的表達(dá)均高于礦化組和細(xì)胞組,統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異(P0.05)。 結(jié)論：體外研究表明100ng／mlGDF-5有誘導(dǎo)hADSCs分化為成骨細(xì)胞的潛能。 第三部分：GDF-5誘導(dǎo)hADSCs復(fù)合納米羥基磷灰石／膠原／聚乳酸體內(nèi)成骨的研究 目的：觀察GDF-5誘導(dǎo)的hADSCs復(fù)合納米羥基磷灰石／膠原／L-聚乳酸裸鼠皮下成骨的能力 方法：取對數(shù)生長期hADSCs,接種于納米羥基磷灰石／膠原／L-聚乳酸支架材料上,構(gòu)建細(xì)胞／支架材料三維培養(yǎng)模型,掃描電鏡(SEM)觀察細(xì)胞在支架上的生長情況。然后,將其分別置于L-DMEM、礦化液、GDF-5體外培養(yǎng)一周后,移植入裸鼠背部皮下,4w、12w后取材,HE染色、Goldner's染色觀察支架材料復(fù)合體在裸鼠皮下成骨情況。 結(jié)果：hADSCs能粘附在納米羥基磷灰石／膠原／L-聚乳酸(nanohydroxyapatite/collagen/L-poly lactic acid, nHAC/PLA)支架材料的表面,生長良好；細(xì)胞／支架材料復(fù)合體經(jīng)GDF-5誘導(dǎo)后4w、12w后取材均可見類骨質(zhì)形成,并逐漸取代支架材料,周圍未見明顯炎癥反應(yīng)。其中GDF-5組成熟的骨及血管形成數(shù)量明顯多于其他兩組。 結(jié)論：納米羥基磷灰石／膠原／L-聚乳酸是有利于ADSCs成骨分化的良好的支架材料；GDF-5可促進(jìn)hADSCs復(fù)合納米羥基磷灰石／膠原／L-聚乳酸異位成骨效應(yīng)。
[Abstract]:Bone morphogenetic protein - 2 ( BMP2 ) , bone morphogenetic protein 7 ( BMP7 ) , growth differentiation factor 5 ( GDF - 5 ) , transforming growth factor - 尾 ( transforming growth factor - 尾 ) , platelet - derived growth factor ( PDGF ) , insulin - like growth factor ( insulin - like growth factor ) . GDF - 5 is a member of transforming growth factor superfamily and bone morphogenetic protein subfamily . It plays an important role in the development of cartilage and bone formation .



The full text is divided into three parts :



Part I : Isolation , Culture and Biological Characteristics of hADSCs



Objective : To study the growth characteristics , surface antigen characteristics and lateral differentiation potential of hADSCs .



Methods : The fat stromal cells were isolated from the fresh adipose tissue and collagenase digestion method taken from healthy individuals , and the morphological characteristics were observed by reversed phase contrast microscope .
Growth and proliferation of hADSCs were measured by MTT assay .
The surface antigen was analyzed by flow cytometry .
waveform silk protein , keratin immunofluorescence staining to identify its source ;
On the basis of cell identification , it was induced to differentiate into osteoblast , and the differentiation potential was analyzed by alkaline phosphatase staining , collagen immunofluorescence staining and alizarin red staining of calcium nodules .
At the same time , the fat - forming induction solution was used to induce differentiation of fat cells , and the oil - red - 0 staining was used for the differentiation and identification of fat .



Results : The morphology of hADSCs in primary culture and subculture was uniform , and the growth ability was vigorous .
The proliferation curves of P3 , P5 and P10 hADSCs were approximately the same and approximately " S " ;
The expression of CD29 , CD44 , CD105 and the expression of CD29 , CD44 , CD105 and the expression of CD29 , CD44 and CD105 on the surface of the mesenchymal cells were expressed by the expression of CD29 , CD44 , CD105 and so on .
Immunofluorescence staining of P4 generation hADSCs was positive , keratin was negative . After 21 days of induction of bone formation , alkaline phosphatase staining showed red nodules , and red nodules were stained with alizarin red staining .



Conclusion : The cells from the source of fat - absorbing operation have the characteristics of undifferentiated hADSCs . Under the condition of in vitro induction , they can differentiate into bone - forming and fat - forming directions , and have the potential of lateral differentiation .



Part Two : In Vitro Study on the Osteogenic Differentiation of hADSCs Induced by GDF - 5



Objective : To study the effect of GDF - 5 on the osteogenic differentiation of hADSCs in vitro .



Methods : GDF - 5 was divided into 0 , 1 , 10 , 100 , 500 ng / ml 5 concentrations . The effects of different concentrations of GDF - 5 on proliferation of hADSCs were analyzed by MTT method .
The effects of GDF - 5 on proliferation and differentiation of P4 - generation hADSCs were analyzed by Western Blot .



Results : 100 ng / ml GDF - 5 promoted the optimal concentration of hADSCs into bone ;
The proliferation of hADSCs was promoted by three groups of medium , but the proliferation of GDF - 5 group was significantly lower than that in the other two groups ( P0.05 ) .
The results showed that GDF - 5 group had the most significant effect on bone differentiation , the activity of alkaline phosphatase , Runx2 , osteal , colI , VEGF gene and protein were all higher than those in mineralized group and cell group ( P0.05 ) .



Conclusion : In vitro studies indicate that 100ng / ml GDF - 5 has the potential to induce differentiation of hADSCs into osteoblasts .



The third part : GDF - 5 induced bone formation in hADSCs / collagen / polylactic acid in vivo



Objective : To observe the ability of GDF - 5 - induced hADSCs to synthesize hydroxyapatite / collagen / L - poly ( lactic acid ) nude mice



Methods : The logarithmic growth of hADSCs was carried out on the scaffolds of hydroxyapatite / collagen / L - polylactic acid , and the growth of the cells on the scaffold was observed by scanning electron microscope ( SEM ) . Then , they were cultured in L - DMEM , mineralized fluid and GDF - 5 respectively for one week , then transplanted into the skin of nude mice , and then treated with HE staining and Goldner ' s staining .



Results : The hADSCs were able to adhere to the surface of nano hydroxyapatite / collagen / L - poly lactic acid ( nS / PLA ) scaffold material and grow well .
After GDF - 5 induction , the cells / scaffold composites showed similar bone formation after 4w and 12w , and gradually replaced the scaffold material . There was no obvious inflammatory reaction around them . Among them , GDF - 5 composed of well - cooked bone and blood vessels was significantly larger than the other two groups .



Conclusion : Nano - hydroxyapatite / collagen / L - poly ( lactic acid ) is a good scaffold material for the differentiation of ADSCs into bone .
GDF - 5 can promote the ectopic osteogenesis of hADSCs / collagen / L - polylactic acid .

【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R329

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1794508