發(fā)布時間：2018-04-23 23:12

  本文選題：微囊藻毒素-LR + 免疫親和層析��； 參考：《華中科技大學(xué)》2009年碩士論文

【摘要】：一、目的和意義 微囊藻毒素(Microcystins, MCs)是淡水湖泊中由藍(lán)細(xì)菌產(chǎn)生的一類天然毒素。其中以微囊藻毒素-LR (Microcystin-LR, MC-LR)急性毒性最強,危害最大。目前已有多種分析方法對水中的藻類毒素進(jìn)行檢測,它們是蛋白磷酸酶抑制試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)、高效液相色譜(high performance liquid chromatography, HPLC)以及HPLC聯(lián)用質(zhì)譜法等。但由于水體中的干擾物質(zhì)比較多,可能會影響以上方法最終檢測結(jié)果的判定,通常需對樣品進(jìn)行前處理。傳統(tǒng)的預(yù)分離方法是用反相C18柱富集水中的藻毒素,但許多研究表明反相C18柱預(yù)分離后的水樣仍含有少量干擾物,故亟需一種分離效果更好的方法或技術(shù)。免疫親和層析以其具有分離復(fù)雜樣品中靶物質(zhì)的高度特異性和高效性特點被大家所關(guān)注。 本文將探討構(gòu)建藻毒素免疫親和層析柱制備過程中的主要影響因素,包括：抗體(配體)的純化,載體的選擇、偶聯(lián)抗體的最佳濃度,配體與載體的偶聯(lián)時間、載體殘留活性基團(tuán)的封閉時間等,以建立一種特異性高、吸附性能好、洗脫分離完全的免疫親和層析預(yù)分離藻毒素的方法,為環(huán)境水體中藻毒素的篩選與檢測探索新方法、創(chuàng)建新技術(shù)。 二、方法 1.采用飽和硫酸銨方法純化抗微囊藻毒素的多克隆抗體,用紫外分光光度法檢測純化濃縮后的抗體濃度,間接ELISA測定抗體效價。以純化后的抗體配體和交聯(lián)瓊脂糖凝膠-4B(Sepharose CL-4B)作為載體,用活化劑N,N'-羰基二咪唑(CDI)活化載體,然后在硼酸緩沖液中促使活化的載體與配體偶聯(lián)。分別從偶聯(lián)的抗體濃度、偶聯(lián)時間、封閉時間上優(yōu)化免疫親和柱的制備條件。測定偶聯(lián)率和配體結(jié)合量。免疫親和柱吸附藻毒素后,采用甲醇作為洗脫劑,并篩選最佳洗脫體積。從柱容量、柱抗體與抗原的特異性、柱間差異等方面對所制備的免疫親和柱進(jìn)行評價。 2.運用所制備的免疫親和柱聯(lián)用ELISA方法測量環(huán)境水體中藻毒素的含量,并同C18柱的吸附效果相比較。在水樣中加入定量的標(biāo)準(zhǔn)品MC-LR測量加標(biāo)回收率,檢測免疫親和層析聯(lián)用ELISA方法的準(zhǔn)確性。 三、結(jié)果 紫外分光光度法檢測純化濃縮后抗體的濃度為85.78mg/ml,用間接ELISA方法測定抗體效價介于1：16000-1：32000之間,抗體的親和常數(shù)介于2.798×107-5.596×107之間。免疫親和層析的制備過程中,偶聯(lián)抗體的濃度確定為8mg/ml,偶聯(lián)時間為24h,封閉條件為pH 8.0、1.0mol/L乙醇胺封閉4h。免疫親和柱吸附藻毒素過程中,洗脫液CH3OH的體積確定為10ml。本實驗所制備的免疫親和柱對藻毒素具有特異性吸附作用；柱容量在233.1ng-284.5ng之間；柱間差異較小,標(biāo)準(zhǔn)差為97.27%±2.86%,變異系數(shù)為0.029；同 一免疫親和柱對標(biāo)準(zhǔn)品的回收率達(dá)95%左右。免疫親和柱對環(huán)境水樣中藻毒素的吸附效果與國家規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)C18柱效果一致。免疫親和柱聯(lián)用ELISA方法檢測水樣加標(biāo)回收率分別是75.97%±2.7%,72.49%±2.1%。 四、結(jié)論 純化濃縮的抗體親和常數(shù)介于2.798×107-5.596×107之間,滿足免疫親和層析抗體親和常數(shù)需介于107-1012之間的要求。制備的免疫親和柱對藻毒素具有特異性吸附作用。親和柱間差異很小,變異系數(shù)為0.029。免疫親和柱吸附效果與國家標(biāo)準(zhǔn)反相C18柱比較無顯著性差異,吸附效果肯定。
[Abstract]:I . Purpose and significance

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本文編號：1794064