本文選題：let-7 + miR-21��； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2010年碩士論文

【摘要】：研究背景 紫外線(ultraviolet, UV)是電磁波譜中波長為100-400nm的輻射的總稱。人類社會活動中的紫外線來源主要是太陽及少量的人工光源,而太陽光譜中,紫外線約占5%。根據(jù)國際通行的分類方法,UVB是指波長為280-315nm的中波紫外線。太陽光譜中除UVB外,還有短波紫外線UVC和長波紫外線UVA。但太陽光中的UVC在經(jīng)過地球大氣層時幾乎全被臭氧層吸收,不能到達(dá)地球表面對人體產(chǎn)生作用；UVA約占到達(dá)地面的太陽光紫外線的95%,對衣物和人體皮膚的穿透性強,可達(dá)到真皮層處。它可對皮膚中黑色素起作用,引起色素沉著并使皮膚變黑,反過來起到防御紫外線保護(hù)皮膚的作用。 本研究關(guān)注的UVB雖然在太陽光紫外線中含量較少,只占到達(dá)地球的紫外線的4%-5%,卻是活性最強的組成部分。它致皮膚日光灼傷的能力是UVA的1000倍,比UVA更具有遺傳毒性,能夠誘導(dǎo)形成環(huán)丁烷-嘧啶二聚體和嘧啶-嘧啶酮光產(chǎn)物,造成細(xì)胞內(nèi)DNA的直接損傷,進(jìn)一步導(dǎo)致凋亡、變異的發(fā)生。 雖然到達(dá)地球的UVB只占太陽光中全部到達(dá)地球的紫外線的4%-5%,但是它的波長正好在DNA和蛋白質(zhì)的吸收峰附近,可以引起DNA和蛋白質(zhì)的損傷。而且,隨著近年來人類活動對地球大氣臭氧層的破壞加劇,紫外線對人體的損傷作用日益受到人們的重視。但是目前人們對紫外線誘導(dǎo)的DNA損傷、細(xì)胞周期阻滯及凋亡的分子機制的研究仍多限于蛋白編碼基因,而非蛋白編碼基因microRNA基因是否也在紫外線導(dǎo)致?lián)p傷的機制中發(fā)揮作用少見報道。microRNA是一類大小為22nt左右的非編碼單鏈小分子RNA,最初于1993年由研究人員在研究果蠅發(fā)育的時序性調(diào)控過程中發(fā)現(xiàn)。最先發(fā)現(xiàn)的microRNA只有l(wèi)in-4和let-7,隨著近年來研究的深入,人們發(fā)現(xiàn)了越來越多的microRNA分子。雖然逐步明白了它們參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡和增殖分化等諸多生物學(xué)過程以及某些疾病諸如腫瘤和代謝性疾病的發(fā)生和發(fā)展的一些機制,但是未知仍然遠(yuǎn)大于已知。 根據(jù)本實驗室Guo L等人利用微陣列芯片對UVB照射后NIH3T3細(xì)胞microRNA差異表達(dá)的研究結(jié)果,NIH3T3細(xì)胞在UVB照射后不同的時間點,細(xì)胞內(nèi)數(shù)十種microRNA分子均出現(xiàn)了不同程度的表達(dá)上調(diào)或下調(diào)�？紤]到微陣列芯片技術(shù)雖然具有高通量、操作簡便等優(yōu)點,但是也具有敏感性和特異性不高的缺點,因此我們選擇其中的let-7、miR-21和miR-24三種對UVB敏感的microRNA分子,用不同的實驗方法對其是否參與紫外線誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡進(jìn)行了初步的研究。 研究目的 對microRNA分子let-7、miR-21和miR-24是否參與紫外線誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡進(jìn)行初步研究,觀察細(xì)胞內(nèi)let-7、miR-21和miR-24的表達(dá)水平在UVB誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的變化情況,推論其在細(xì)胞凋亡中的促進(jìn)或抑制作用,并通過靶基因預(yù)測軟件,初步預(yù)測它們在細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的作用機制。 研究方法 1. NIH3T3細(xì)胞和HaCaT細(xì)胞的體外培養(yǎng) NIH3T3細(xì)胞和HaCaT細(xì)胞分別在含有10%小牛血清的MEM和DMEM培養(yǎng)液中,于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。 2. NIH3T3細(xì)胞和HaCaT細(xì)胞的UVB照射 用紫外燈對NIH3T3細(xì)胞和HaCaT細(xì)胞進(jìn)行照射。紫外燈為上海市計量測試技術(shù)研究院生產(chǎn),并經(jīng)上海市計量局檢測,其發(fā)射的紫外線波峰為305nm,照射時光源距樣品垂直距離為40cm,此距離的紫外燈功率為16.5μW／m2。細(xì)胞照射前棄去培養(yǎng)基,PBS清洗兩遍后,加入與培養(yǎng)基等體積的PBS、移開培養(yǎng)皿蓋子進(jìn)行照射。照后將PBS置換成新鮮培養(yǎng)基,細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng),待檢測各項指標(biāo)。 3. Hoechest33342/PI染色觀察NIH3T3細(xì)胞凋亡 NIH3T3細(xì)胞經(jīng)UVB照射后(對照組無照射)繼續(xù)培養(yǎng)12h, PBS清洗2次,按照Vybrant(?) Apoptosis Assay Kit #7試劑盒(美國Invitrogen公司,Cat#V-23201, Molecular Probes)進(jìn)行操作。在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并攝片。 4.MTT和流式細(xì)胞術(shù)檢測HaCaT細(xì)胞UVB照射后的形態(tài)學(xué)變化 進(jìn)行MTT檢測的HaCaT細(xì)胞接種在96孔板中200μl／孔,10 OOOcells/孔；行流式細(xì)胞技術(shù)檢測的細(xì)胞接種在直徑為80mm的培養(yǎng)皿中。HaCaT細(xì)胞照射分組按兩種方式進(jìn)行：(1)按細(xì)胞受照劑量(受照時間)不同,分為對照組和不同劑量的照射組,照后繼續(xù)培養(yǎng)12h進(jìn)行檢測；(2)按細(xì)胞照射后培養(yǎng)時間不同,分為對照組和照射后培養(yǎng)不同時間的照射組。 對于MTT實驗,各組細(xì)胞到培養(yǎng)時間點后,向各孔細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)加入MTT使其終濃度為0.5mg/ml。繼續(xù)孵育4-6h,棄盡培養(yǎng)基,用DMSO完全溶解甲佨顆粒,用酶標(biāo)儀測定OD值。 對于流式細(xì)胞技術(shù),各組細(xì)胞到培養(yǎng)時間點后,收集培養(yǎng)皿中細(xì)胞,經(jīng)PBS洗滌后用預(yù)冷的70%乙醇4℃固定至少24h,然后使用終濃度為100μg/ml的PI和100μg/ml的RNaseA染色、檢測。 5. NIH3T3細(xì)胞microRNA及HaCaT細(xì)胞總RNA的提取 NIH3T3細(xì)胞照射5min后,置于5%CO2的孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)。12h后棄上清,PBS清洗2次。Hacat細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)2h,4h,8h,12h和24h后,NIH3T3細(xì)胞小RNA和HaCaT細(xì)胞總RNA均按照試劑盒mirVanaTM microRNA Isolation (Cat#1560, Ambion)的操作步驟提取。 6.PCR檢驗let-7和miR-24的表達(dá) Mmu-let-7、mmu-miR-24和5S的引物購于Ambion公司。在反應(yīng)管中加入提取的small RNA、oligo dT Primer, Random 6 mers及逆轉(zhuǎn)錄酶合成第一鏈,反應(yīng)條件為37℃30min；95℃10min。取5μl的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴增,擴增產(chǎn)物大小為90bp。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性3min；95℃變性60 sec；60℃退火30 sec,40個循環(huán)。以5S為內(nèi)參照在同一反應(yīng)管內(nèi)同步擴增。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離與DNA分子量Marker進(jìn)行比較。 7. Real-time PCR檢驗miR-21的表達(dá) miR-21的引物和內(nèi)參U6的引物購自ABI公司(Cat#4373194,Cat#4373381),應(yīng)用TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (Cat#4366596)和TaqMan Universal PCR Master Mix試劑盒(Cat#4324018)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)并在Stratagene MX3000P上進(jìn)行Real-time PCR,反應(yīng)條件如下：37℃反應(yīng)30min、95℃孵育10min,95℃15sec,60℃1min進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；95℃預(yù)變性3min；95℃變性60sec；60℃退火30sec,40個循環(huán)進(jìn)行擴增。 擴增結(jié)束記錄各模板Ct值,將同一樣本中目的基因的Ct值與內(nèi)參基因的Ct值相減,所得出的△Ct為目的基因相對于內(nèi)參基因的表達(dá)強度,即△Ct=目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct。計算△△Ct,△△Ct=處理樣本△Ct-未處理樣本△Ct,再使用2-ΔΔCt方法將目的基因的表達(dá)差異通過處理樣本相對于未處理樣本的倍數(shù)來表示。2-ΔΔCt1,目的基因表達(dá)上調(diào),反之下調(diào)。 8. Real-time PCR檢驗miR-21的表達(dá)的統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)來表示,熒光定量PCR結(jié)果ΔCt值的比較采用One-way ANOVA,6個時間點的細(xì)胞ΔCt值的多重比較采用SNK法(Student-Neuman-Keuls)。 9.let-7、miR-21和miR-24靶基因的預(yù)測及生物信息學(xué)分析 以let-7、miR-21和miR-24為檢索詞,在MicroCosm、PicTar和Targetscan三個數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶基因預(yù)測,將分別預(yù)測的結(jié)果取交集,即得到預(yù)測的可信度和準(zhǔn)確性相對較高的靶基因。將取交集后得到的靶基因進(jìn)行初步的基因功能分析(Gene Ontology enrichment analysis),概括靶基因主要發(fā)揮的生物學(xué)功能。 研究結(jié)果 1. Hoechest33342/PI染色觀察NIH3T3細(xì)胞凋亡 NIH3T3細(xì)胞照射后經(jīng)Hoechst33342/PI染色,對照組以正常細(xì)胞居多,熒光染色很淺,染色質(zhì)均勻,核形態(tài)規(guī)則；而當(dāng)UVB照射5min后,則可見典型的凋亡和壞死細(xì)胞。凋亡細(xì)胞主要攝取Hoechst染料,呈現(xiàn)強藍(lán)色熒光,細(xì)胞核固縮核染色質(zhì)邊集熒光信號強；而壞死細(xì)胞主要攝取PI而呈強紅色熒光。 2.PCR檢驗let-7和miR-24的表達(dá) let-7和miR-24在UVB照射組和未照射組NIH3T3細(xì)胞中均有表達(dá),但是在UVB照射組的NIH3T3細(xì)胞中表達(dá)水平明顯高于未照射組。 3.UVB照射后HaCaT細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變(MTT法和流式細(xì)胞術(shù)) MTT法檢測HaCaT細(xì)胞UVB受照后生存率,結(jié)果顯示,無論是隨細(xì)胞受照劑量增大,還是隨細(xì)胞照射后培養(yǎng)時間的延長,細(xì)胞的生存率均越來越低。流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞周期的結(jié)果顯示,經(jīng)不同劑量的UVB照射和照射后培養(yǎng)不同時間的細(xì)胞都出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞周期阻滯。 4. Real-time PCR檢驗miR-21的表達(dá)及統(tǒng)計學(xué)分析 miR-21在經(jīng)UVB照射后HaCaT細(xì)胞中,在2-4h內(nèi),其表達(dá)水平是升高的,在隨后的8h,其表達(dá)水平與對照組相比降低了一半。 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示,熒光定量PCR結(jié)果ΔCt值的比較采用One-way ANOVA, P0.05,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。多重比較后發(fā)現(xiàn)miR-21在對照組和照后2h、4h、8h和12h之間有顯著差異。但是運用2-ΔΔCt方法檢測microRNA的表達(dá)水平差異時,只要2-ΔΔCt的數(shù)值改變達(dá)到2倍以上,便可說明差異有顯著意義,即miR-21在對照組和照射后2h、4h、8h組之間的表達(dá)差異顯著。 5.let-7、miR-21和miR-24靶基因的預(yù)測及生物信息學(xué)分析 我們利用MicroCosm、PicTar和Targetscan等軟件分別對let-7、miR-21和miR-24的靶基因進(jìn)行預(yù)測并對預(yù)測結(jié)果進(jìn)行了功能分類,從中我們可以看出casp3、bcl2、bcl212、map3k1、cdk5、pik3r1、e2f3等基因參與了細(xì)胞的分化及細(xì)胞的周期進(jìn)程,同時它們也是UVB所致?lián)p傷的分子機制的重要基因,據(jù)此我們可以推斷,microRNA也參與了UVB所致?lián)p傷的分子機制。 結(jié)論 通過對未經(jīng)UVB照射和被UVB照射過以及UVB照射后不同時間的細(xì)胞中microRNA分子let-7、miR-21和miR-24的表達(dá)水平進(jìn)行研究,我們初步推斷l(xiāng)et-7、miR-21和miR-24參與了UVB誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮了作用。研究結(jié)果顯示,在受到50J/m2的UVB照射后,NIH3T3細(xì)胞中l(wèi)et-7的表達(dá)量有明顯的增加。而此時細(xì)胞受UVB照射后發(fā)生了一定程度的凋亡,這提示let-7可能參與UVB誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的分子機制。miR-24在受到紫外線照射的NIH3T3細(xì)胞中表達(dá)量也增高,初步說明let-7和miR-24具有促凋亡的作用。 而對于miR-21,發(fā)現(xiàn)它在受UVB照射后凋亡的HaCaT細(xì)胞中的表達(dá)變化是時間依賴性的。在照射后2h的HaCat細(xì)胞中其表達(dá)水平升高的倍數(shù)最大,為未照射的對照組細(xì)胞的6倍,4h時為5倍,而在8h時,其表達(dá)水平降低1/2以上,12h以后其表達(dá)水平改變不明顯。 我們進(jìn)一步運用生物信息學(xué)的方法對let-7、miR-21和miR-24的靶基因進(jìn)行預(yù)測和分類,從預(yù)測結(jié)果可以看到Casp3、Bcl2、Bcl212、Map3k1、Cdk5、Pik3r1、E2f3等參與了細(xì)胞的分化及細(xì)胞周期進(jìn)程的基因,從let-7和miR-24的靶基因分析,可以看到其靶基因與UVB誘導(dǎo)損傷的靶基因有大量重合,據(jù)此初步推斷microRNA參與了UVB誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡等損傷的分子機制。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R363

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

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本文編號：1786749