本文選題：糖皮質(zhì)激素 + 低氧��； 參考：《第二軍醫(yī)大學》2010年碩士論文

【摘要】： 低氧是一種常見的非基因毒應激,已證實機體對缺氧損傷的習服與適應受糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid, GC)的影響。在低氧條件下分泌增多的GC能通過糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor, GR)的介導,調(diào)節(jié)基因表達,但是至今對于參與了低氧適應的糖皮質(zhì)激素／受體(GC/GR)的靶基因還知之不多。小G蛋白RhoB是近年來我們發(fā)現(xiàn)的一個新的GC/GR上調(diào)蛋白。國內(nèi)外近年來的研究表明,RhoB是一個早期反應基因,能夠被多種基因毒應激原(致DNA損傷),如放射線、紫外線、抗癌藥(如5-氟脲嘧啶、順鉑)等上調(diào)或使其激活,并有報道RhoB上調(diào)能夠促進細胞存活�？紤]到RhoB是GC/GR調(diào)節(jié)蛋白,因此推測該蛋白有可能也在低氧中起作用,本課題從在體和離體兩個水平觀察了低氧對RhoB表達的影響,并進一步研究了低氧影響RhoB表達的機制,以進一步闡明GC對低氧適應的機制。 我們首先將Sprague Dawley (SD)大鼠放入含8%02、92%N2的混合氣體的低氧艙內(nèi)不同時間復制急性缺氧大鼠模型,采用Real-time PCR及Western blot方法檢測了大鼠肺組織中RhoB mRNA及蛋白的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),大鼠肺組織中RhoB mRNA在低氧后8h時開始上調(diào),12h時達到最大值；而大鼠肺組織中RhoB蛋白在低氧后16h表達量最高。 已有實驗表明低氧暴露的動物血液中糖皮質(zhì)激素明顯增高,為了確定GC在機體上調(diào)RhoB表達的過程中發(fā)揮了多大的作用,我們摘取了大鼠的腎上腺以去除內(nèi)源性腎上腺激素對RhoB表達的影響。我們將大鼠隨機分為假手術(shù)常氧組、假手術(shù)低氧組、其余去腺后分為常氧組、低氧組、Dex組和低氧加Dex共處理組。對肺組織RhoB mRNA的檢測結(jié)果顯示,去腺常氧組大鼠RhoB mRNA的表達與假手術(shù)常氧組相比略有降低；去腺Dex組和去腺低氧組大鼠RhoB mRNA分別與去腺常氧組相比均有明顯增高；而去腺大鼠用Dex和低氧聯(lián)合處理,RhoB mRNA的表達增加更為明顯。RhoB蛋白也有類似的變化。研究結(jié)果表明在體內(nèi)低氧和Dex均能上調(diào)RhoB的表達,而且二者聯(lián)合具有疊加或協(xié)同作用。 為了排除整體低氧時體內(nèi)增多的神經(jīng)內(nèi)分泌激素及相關(guān)的一些因子對RhoB表達的影響,考慮到肺上皮細胞和巨噬細胞是肺組織中兩種最重要的細胞,我們進一步觀察了低氧對體外培養(yǎng)的人肺腺癌細胞系A(chǔ)549細胞、小鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞中RhoB表達的影響。將細胞置于含有1%O2的低氧孵箱,在低氧條件下培養(yǎng)細胞不同時間后測定其RhoB mRNA和蛋白的表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn)低氧處理能快速上調(diào)RhoB mRNA和蛋白的表達。同時,我們用氯化鈷模擬低氧,也得到了相似的結(jié)果。 對低氧上調(diào)RhoB表達的機制研究發(fā)現(xiàn),低氧能增強RhoB mRNA和蛋白的穩(wěn)定性,說明低氧對RhoB的上調(diào)可以發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后和翻譯后水平。我們觀察了MAPK家族成員(ERK, JNK, p38)在低氧上調(diào)A549細胞RhoB表達中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),用ERK和p38的抑制劑處理細胞,對低氧上調(diào)RhoB沒有明顯影響,但是JNK的抑制劑SP600125可明顯抑制低氧對胞RhoB蛋白的上調(diào)作用,同時低氧還能明顯增加磷酸化JNK的水平。該結(jié)果表明低氧能通過激活JNK,上調(diào)RhoB的表達,ERK和p38則不參與該過程。 我們的研究也證實Dex能在A549和RAW264.7細胞中上調(diào)RhoB mRNA和蛋白的表達。Dex時間依賴性上調(diào)RhoB蛋白表達可持續(xù)至24h甚至更長,而其對RhoBmRNA的上調(diào)非常快速,2h就達到高峰。兩者雖然趨勢不一致,但并不矛盾,蛋白水平的調(diào)節(jié)本來就慢于mRNA,再加上mRNA的累積,蛋白表達逐漸增多也是正常的。 我們進一步觀察了低氧、GC單獨或聯(lián)合作用對A549細胞RhoB mRNA和蛋白表達的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)低氧與Dex二者聯(lián)合處理后RhoB mRNA的表達上調(diào)更加顯著,蛋白表達也得到類似的結(jié)果,提示二者對RhoB表達有疊加或者協(xié)同作用。 綜上所述,本實驗首次發(fā)現(xiàn)低氧能夠在整體水平和細胞水平上調(diào)RhoB mRNA和蛋白的表達。低氧上調(diào)RhoB的表達與其提高RhoB mRNA和蛋白的穩(wěn)定性有關(guān),還有JNK通路激活參與了低氧上調(diào)RhoB的表達,而ERK和p38沒有參與。本課題所得的結(jié)果為進一步研究低氧調(diào)節(jié)RhoB表達的機制和生物學意義打下了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Hypoxia is a kind of common non - toxic stress . It has been proved that the organism has no effect on hypoxia injury . It has been shown that RhoB is an early response gene , which can regulate gene expression by regulating the expression of glucocorticoid receptor ( GR ) .


The expression of RhoB mRNA and protein in lung tissues of rats was detected by Real - time PCR and Western blot . The results showed that RhoB mRNA was up - regulated at 8 h after hypoxia and reached its maximum at 12 h after hypoxia .
The expression of RhoB protein in rat lung tissue was the highest after hypoxia .


In order to determine the effect of GC on the expression of RhoB , the effects of endogenous adrenocorticoids on RhoB expression were observed .
The expression of RhoB mRNA was significantly higher than that of the deglandular normal oxygen group .
Meanwhile , the expression of RhoB mRNA was significantly increased . The results showed that both in vivo hypoxia and dexamethasone could up - regulate the expression of RhoB , and the combination of both has a superposition or synergistic effect .


The effects of hypoxia on the expression of RhoB mRNA and protein in human lung adenocarcinoma cell line A549 and mouse macrophage system RAW264.7 cells cultured in vitro were investigated .


It was found that hypoxia could enhance the stability of RhoB mRNA and protein . The effect of hypoxia on the expression of RhoB in A549 cells was observed . The results showed that ERK and p38 inhibitors were used to regulate the expression of RhoB in A549 cells .


The expression of RhoB mRNA and protein could be up - regulated in A549 and RAW264.7 cells .


The effects of hypoxia and GC on the expression of RhoB mRNA and protein in A549 cells were investigated .


In conclusion , hypoxia can increase the expression of RhoB mRNA and protein at the whole level and cell level . Hypoxia can increase the expression of RhoB and increase the expression of RhoB mRNA and protein . The result of this study lays a foundation for further study on the mechanism and biological significance of hypoxia regulation RhoB expression .

【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R363

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本文編號：1784272