本文選題：vWF + A1A2A3區(qū)　； 參考：《蘇州大學(xué)》2010年碩士論文

【摘要】： 血管性血友病因子(vWF)是有黏附特性的超大分子量的多聚體蛋白,由內(nèi)皮細(xì)胞和巨核細(xì)胞／血小板合成,這種有著獨(dú)特分子結(jié)構(gòu)的蛋白在止血與血栓形成過程中起著重要的作用,而一旦VWF的質(zhì)或量的改變,就發(fā)生血管性血友病(VWD)。血漿vWF以多種形式參與止血過程,可與血小板膜糖蛋白(GP)Ⅰb/Ⅸ/Ⅴ、GPⅡb/Ⅲa結(jié)合,還可與內(nèi)皮下暴露的膠原結(jié)合,促使血小板在損傷的部位黏附,加速血小板的聚集,形成血小板血栓,在初期止血中起著重要的作用。但血漿中超大分子量vWF多聚體增多,可引起全身或局部血栓栓塞,導(dǎo)致血栓性血小板減少性紫癜(TTP)的發(fā)生。 本文主要根據(jù)膠原-vWF-GPⅠb相互作用的關(guān)系,針對(duì)vWFA1、A2、A3功能區(qū)進(jìn)行研究。以人全長(zhǎng)vWF cDNA為模板,應(yīng)用基因重組技術(shù)克隆了vWFA1A2A3功能結(jié)構(gòu)域的基因片段,并在原核和真核細(xì)胞中表達(dá),觀察并比較了兩種重組蛋白的生物學(xué)功能。 目的：vWF-A1區(qū)含有血小板糖蛋白(GP)Ⅰba、瑞斯脫霉素(ristocetin)、肝素、脂類和膠原的結(jié)合位點(diǎn),是vWF發(fā)揮生物學(xué)功能的重要結(jié)構(gòu)區(qū)域。vWF-A3區(qū)是膠原纖維Ⅰ和Ⅲ型的結(jié)合部位。vWF-A2區(qū)含有血管性血友病因子裂解蛋白酶(ADAMTS13,也稱vWF-CP)的裂解位點(diǎn)。本研究分別構(gòu)建了人血管性血友病因子A1A2A3區(qū)(VWF-A1A2A3)編碼序列基因原核及真核表達(dá)載體,并分別在大腸桿菌和中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)細(xì)胞中表達(dá),為探討VWF-A1A2A3的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。 方法：我們根據(jù)已公布的序列設(shè)計(jì)引物,用PCR方法從vWF cDNA中擴(kuò)增出人VWF-A1A2A3編碼序列基因片段(rvWF-A1A2A3),測(cè)序正確后用限制性內(nèi)切酶將目的片段分別插入PET-21b和pSectag2b載體中。采用酶切和PCR鑒定后,分別通過CaCl2轉(zhuǎn)染至大腸桿菌和脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染至CHO細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。用Ni-NTA agarose柱純化表達(dá)產(chǎn)物后,western blot生化鑒定目的蛋白。ELISA做膠原結(jié)合試驗(yàn)和ristocetin誘導(dǎo)下的血小板結(jié)合實(shí)驗(yàn)研究重組蛋白的生物學(xué)功能。并在在尿素變性的條件下用ADAMTS-13對(duì)重組蛋白進(jìn)行切割后做western blot鑒定。 結(jié)果：應(yīng)用RT-PCR方法以人全長(zhǎng)vWF cDNA為模板獲得了VWF-A1A2A3的編碼基因。測(cè)序證明克隆的基因序列完全正確,然后分別構(gòu)建了表達(dá)載體pET-21b-vWF-A1A2A3以及pSectag2b-VWF-A1A2A3后,分別在大腸桿菌和CHO進(jìn)行表達(dá)。 原核表達(dá)的rvWF-A1A2A3經(jīng)次氮基三乙酸鎳瓊脂糖(Ni-NTA agarose)柱純化后,目的蛋白的純度均在95%以上。將純化的重組目的蛋白通過透析復(fù)性后進(jìn)行了生物學(xué)功能的研究。真核表達(dá)無血清培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)在于無需進(jìn)行蛋白的變性及復(fù)性過程,最大程度地保留了重組蛋白原有的空間結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,重組vWF-A1A2A3 (rvWF-AlA2A3)蛋白具有良好的免疫學(xué)及生物學(xué)活性。 rvWF-A1A2A3能夠特異性的與抗His抗體、SZ-34、SZ-123、SZ-125和SZ-129單抗結(jié)合,western blot顯示為單一的特異性的條帶。應(yīng)用ELISA做膠原結(jié)合試驗(yàn)和ristocetin誘導(dǎo)下的血小板結(jié)合實(shí)驗(yàn),檢測(cè)并比較大腸桿菌中高效表達(dá)的與真核表達(dá)的rvWF-AlA2A3的生物學(xué)活性。兩種重組蛋白與人Ⅲ型膠原、血小板均有結(jié)合活性,但原核與真核兩者間的結(jié)合能力有顯著差異,S=10.5,P=0.0313,p0.05,真核與Ⅲ型膠原及血小板的結(jié)合率較原核高。真核表達(dá)的rvWF-A1A2A3蛋白在含尿素、Ca2+/Zn2+緩沖液中能被ADAMTS-13切割成兩個(gè)條帶,且能與抗vWF多抗結(jié)合。 結(jié)論：rvWF-A1A2A3功能區(qū)三聯(lián)體在大腸桿菌和CHO細(xì)胞中成功表達(dá),rvWF-A1A2A3蛋白具有良好的免疫學(xué)及生物學(xué)功能活性,為研究vWF相關(guān)的生物學(xué)結(jié)構(gòu)、功能和臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:VWD is an ultra - large molecular weight multimeric protein with adhesion . It plays an important role in hemostasis and thrombosis . It can be combined with platelet membrane glycoprotein ( GP ) I b / IX / 鈪，

本文編號(hào)：1778607