本文選題：骨髓基質(zhì)干細胞 + 生長因子�。� 參考：《蘇州大學(xué)》2009年博士論文

【摘要】：近年來,對骨髓基質(zhì)干細胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)可塑性的研究進展迅速,BMSCs能夠分化形成包括造血組織在內(nèi)的多種組織細胞,特別是中胚層和神經(jīng)外胚層來源的組織細胞,如骨、軟骨、脂肪、纖維組織、上皮組織和骨髓支持基質(zhì)等多種間充質(zhì)組織,使人們看到了用細胞移植方法治療神經(jīng)退行性疾病的新希望。 2000年Brazelton和Mezey異體移植BMSCs成功,其后才證明BMSCs可向神經(jīng)細胞分化,近年來對BMSCs的促分化因子進行了大量的研究,β-巰基乙醇(beta-mercaptoethanol, BME)、二甲基亞砜(dimethylsulfoxide, DMSO)、4-羥基茴香醚(butylated hydroxyanisole, BHA)、五氮雜胞苷(5-azacytidine)、維甲酸(retinoic acid, RA)等相繼被證實可以誘導(dǎo)BMSCs分化為神經(jīng)元樣細胞。一些生長因子如表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain derived neurotrophic factor, BDNF),和視黃酸、胎鼠中腦或紋狀體細胞懸液共同作用后,在體外也成功誘導(dǎo)成年大鼠和人的BMSCs分化為幼稚的神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞。BMSCs還可被誘導(dǎo)分化為特征類型的神經(jīng)元,如5-HT敏感神經(jīng)元,多巴胺能神經(jīng)元,但膽堿能神經(jīng)元的分化一直是個難題。 BMSCs分化為神經(jīng)細胞的機制十分復(fù)雜,除了表達中胚層mRNA以外,還表達生殖細胞以及內(nèi)、外胚層基因。其向神經(jīng)元的分化受神經(jīng)特異性基因表達量的調(diào)控,而并非由相應(yīng)基因表達的開放與關(guān)閉控制。Sox、Pax、Notch、delta、frizzled、erbB基因以及RB、RB2/P130基因在BMSCs分化中起重要作用,最新研究表明其分化和MAPK信號通路有關(guān)。 雖然有關(guān)BMSCs分化為神經(jīng)元的研究進展迅速,但仍有很多問題未得到解決:首先,誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)干細胞分化為神經(jīng)元的方案中,都存在一些缺陷,如由于化學(xué)誘導(dǎo)劑的毒性而不適合臨床應(yīng)用,某些生長因子雖然能誘導(dǎo)分化,但不能定向分化為特定類型等。雖然誘導(dǎo)BMSCs分化為多巴胺能神經(jīng)元和5-HT敏感神經(jīng)元已經(jīng)成功,但向膽堿能神經(jīng)元的分化至今未見報道。其次,誘導(dǎo)分化的機理研究尚不充分,尤其是分化信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程不明。以往的研究提示,在不同的細胞類型中,同一個信號傳遞過程可能表現(xiàn)出截然相反的結(jié)果,尤其是PI3K-Akt-mTOR通路和MAPK通路在BMSCs向神經(jīng)元分化過程中的作用,僅見兩篇報道。另外,細胞分化過程涉及到結(jié)構(gòu)重建、細胞器重組、凋亡和自噬等復(fù)雜的過程,但與BMSCs向神經(jīng)分化相關(guān)的自噬研究尚屬空白,針對上述問題,本課題開展了一系列的研究。 研究目的: 篩選建立生長因子體外誘導(dǎo)BMSCs分化為膽堿能神經(jīng)元的有效方法;通過采用特異性抑制劑,觀察生長因子誘導(dǎo)BMSCs向膽堿能神經(jīng)元分化的分化率和生存率的變化;通過檢測PI3K-Akt-mTOR通路和MAPK通路蛋白以及p53表達和自噬水平的改變,初步闡明生長因子誘導(dǎo)BMSCs分化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。 研究方法: (1)建立BMSCs培養(yǎng)和擴增方法,用不同濃度NGF誘導(dǎo)BMSCs分化,光鏡觀察分化細胞情況,從中篩選出合適的濃度;用NGF、NGF+bFGF和NGF+EGF+bFGF三種處理方式誘導(dǎo)BMSCs,光鏡觀察分化情況,免疫熒光鑒定MAP-2表達,以篩選有效組合;(2)用LY294002抑制PI3K活性,光鏡觀察其對生長因子誘導(dǎo)分化的影響,免疫熒光鑒定MAP-2和ChAT表達并計算ChAT陽性細胞率,MTT法測定分化細胞死亡率;(3)Western blot檢測生長因子單獨誘導(dǎo)、LY294002單獨作用和兩者共同作用時Akt、ERK激活的變化,p53表達量的變化,以及Cathepsin-B、LC3檢測自噬水平,結(jié)合ChAT陽性細胞率,細胞生存率的結(jié)果,分析誘導(dǎo)分化的信號傳導(dǎo)機制。 實驗結(jié)果: (1)NGF 100 ng/mL有很好的誘導(dǎo)分化作用,NGF+EGF+bFGF聯(lián)合應(yīng)用能誘導(dǎo)BMSCs分化為ChAT陽性神經(jīng)細胞,分化率達60~70%。ChAT陽性細胞率有一定的時間相關(guān)性,誘導(dǎo)后3 h、5 h明顯高于1 h,但3 h后陽性率不再升高(P0.05,與5 h相比);單純抑制PI3K(LY294002組)也能誘導(dǎo)BMSCs分化為ChAT陽性細胞,然而其陽性細胞率在每一個時間點都明顯低于生長因子誘導(dǎo)組;在生長因子與LY294002聯(lián)合處理組,ChAT陽性細胞率明顯高于單純生長因子組。 (2)生長因子誘導(dǎo)BMSCs分化為ChAT陽性神經(jīng)元后,隨著時間延長細胞生存率并無明顯下降,PI3K抑制使分化細胞大量死亡,生存率降低,并明顯抑制生長因子誘導(dǎo)BMSCs分化的膽堿能神經(jīng)元的生存率。 (3)生長因子誘導(dǎo)BMSCs分化后,Akt磷酸化蛋白顯著增多并持續(xù)至5 h;抑制PI3K活性后,Akt有一定的磷酸化激活,但5 h后顯著下降,與對照組相比已無差別。LY294002阻斷PI3K活性后,生長因子對Akt的磷酸化水平在處理后1 h沒有明顯改變,3 h后磷酸化水平明顯增高,至5 h后仍然維持在高水平。 (4)生長因子誘導(dǎo)后1 h ERK1/2明顯激活,顯著高于對照組,3 h和5 h后明顯下降,PI3K抑制可明顯阻滯ERK1/2的激活,但與生長因子聯(lián)合作用后1 h,可增加ERK1/2的水平,3h、5h則明顯低于未抑制組。 (5)生長因子誘導(dǎo)分化后,p53表達上調(diào),PI3K抑制后p53表達量進一步增加,同時生長因子可明顯降低BMSCs誘導(dǎo)分化后的自噬水平,并與PI3K抑制有協(xié)同作用。 結(jié)論: 1.首次發(fā)現(xiàn)NGF、EGF和bFGF聯(lián)合處理可有效誘導(dǎo)BMSCs分化為ChAT陽性的膽堿能神經(jīng)元。 2.生長因子通過激活A(yù)kt誘導(dǎo)BMSCs分化為膽堿能神經(jīng)元,Akt激活需至一定水平才能誘導(dǎo)分化,存在一個“誘導(dǎo)閾值”。 3. ERK1/2的激活是分化細胞生存的重要條件之一,高度激活的Akt誘導(dǎo)信號可引起ERK1/2的激活抑制,從而降低分化細胞的生存率,兩者之間的平衡可維持分化神經(jīng)元的高生存率。 4. p53表達上調(diào)不是降低由BMSCs分化的膽堿能神經(jīng)元生存率的主要因素,但可以協(xié)同ERK1/2激活抑制所致的分化細胞的生存率降低。自噬可能不參與誘導(dǎo)BMSCs向膽堿能神經(jīng)元的分化過程。
[Abstract]:In recent years , the research progress on the plasticity of bone marrow stromal cells ( MSCs ) is rapid , which can differentiate into many kinds of tissue cells including hematopoietic tissues , especially the tissue cells of mesoderm and ectodermal origin , such as bone , cartilage , fat , fibrous tissue , epithelial tissue and bone marrow support matrix , etc . , so as to make people see the new hope of treating neurodegenerative diseases by cell transplantation .

The differentiation of bone marrow cells into neuron - like cells can be induced in vitro . Some growth factors such as epidermal growth factor ( EGF ) , brain derived neurotrophic factor ( BME ) , dimethyl sulfoxide ( DMSO ) , 4 - hydroxyanisole ( BME ) , dimethyl sulfoxide ( 5 - azacytidine ) , retinoic acid ( RA ) and so on have been confirmed to differentiate into neuron - like cells .

In addition to the expression of mesoderm mRNA , the mechanism of differentiation into neural cells is very complex . In addition to the expression of mesoderm mRNA , the differentiation of neurons to neurons is regulated by the expression of nerve - specific genes , but not by the opening and closing controls expressed by the corresponding genes .

Although the differentiation of bone marrow stromal cells into dopaminergic neurons and 5 - HT sensitive neurons has been successful , some growth factors may not be directionally differentiated into specific types . In addition , the differentiation of the cells into dopaminergic neurons and 5 - HT sensitive neurons has not been reported .

Purpose of study :

Screening and establishing the effective method of growth factor in vitro to differentiate into cholinergic neurons ; by using specific inhibitors , we observed the changes of differentiation rate and survival rate induced by growth factor to cholinergic neurons .

Study method :

( 1 ) To establish the culture and amplification method of bone marrow cells . The cells were induced by NGF , NGF + bFGF and NGF + EGF + bFGF .

Experimental results :

(1)NGF 100 ng/mL鏈夊緢濂界殑璇卞鍒嗗寲浣滅敤,NGF+EGF+bFGF鑱斿悎搴旂敤鑳借瀵糂MSCs鍒嗗寲涓篊hAT闃蟲，

本文編號：1777725