本文選題：登革2型病毒 + 3′非編碼區(qū)　； 參考：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2008年博士論文

【摘要】： 登革病毒(DEN)為黃病毒科黃病毒屬(Flavivirus)的重要成員,包括4個(gè)血清型,可引起人類登革熱(DF)、登革出血熱(DHF)和登革休克綜合征(DSS)。其基因組為長約11kb的單股正鏈RNA,包括5′非編碼區(qū)(untranslated region,UTR)、單一開放讀碼框(ORF)和3′非編碼區(qū)。其ORF編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白(C, prM和E)和7種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS)。5′和3′非編碼區(qū)分別長約100與450個(gè)堿基,包括調(diào)控病毒復(fù)制與翻譯的幾個(gè)保守序列元件和二級結(jié)構(gòu)。3′非編碼區(qū)依次包含5個(gè)RNA元件(5′→3′):可變區(qū)(VR)、串聯(lián)的重復(fù)保守序列(RCS)2、保守序列CS2、CS1和莖環(huán)結(jié)構(gòu)SL。 病毒基因組復(fù)制與翻譯是病毒增殖的關(guān)鍵階段,目前對于黃病毒復(fù)制與翻譯的確切機(jī)制仍不清楚。登革病毒非編碼區(qū)在病毒的復(fù)制和翻譯中起重要作用,尤其是3′非編碼區(qū)既可以起始RNA復(fù)制,又參與病毒的翻譯。因此,探討登革病毒3′非編碼區(qū)在復(fù)制與翻譯中的確切機(jī)制對于闡明病毒的致病機(jī)理具有重要意義。 為此,本研究在分析登革病毒基因組結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上,選擇3′非編碼區(qū)的保守序列和二級結(jié)構(gòu)為研究對象,通過構(gòu)建病毒誘導(dǎo)的報(bào)告基因系統(tǒng)(VIRG)及可裂解RNA的脫氧核酶(DRz),探討3′非編碼區(qū)不同序列及不同RNA元件對病毒翻譯的可能調(diào)控機(jī)制,為深入研究登革病毒致病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。研究內(nèi)容主要包括以下三個(gè)部分。 一、登革2型病毒基因組非編碼區(qū)誘導(dǎo)的報(bào)告基因系統(tǒng)(VIRG)的構(gòu)建及鑒定 為了構(gòu)建研究登革病毒3′非編碼區(qū)調(diào)控翻譯的表達(dá)系統(tǒng),我們將登革2型病毒非編碼區(qū)與熒光素酶基因相連構(gòu)建病毒誘導(dǎo)的報(bào)告基因(VIRG)。根據(jù)螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶具有不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)和底物要求及相同的反應(yīng)條件,本研究分別將其與登革病毒非編碼區(qū)相連,經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞等操作過程,在同一樣品中同時(shí)測定兩個(gè)報(bào)告基因,以其中一個(gè)作為內(nèi)對照,從而使檢測結(jié)果避免了每次實(shí)驗(yàn)操作間的誤差帶來的干擾。在BHK細(xì)胞表達(dá)的報(bào)告基因,經(jīng)WB分析具有螢火蟲熒光素酶表達(dá)的特異性,與熒光素酶的活性檢測的結(jié)果表明,本研究構(gòu)建的螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因及內(nèi)對照系統(tǒng)可在BHK細(xì)胞進(jìn)行高效、穩(wěn)定表達(dá),實(shí)驗(yàn)具有良好的重復(fù)性,為下一步探討3′非編碼區(qū)翻譯效率提供了平臺。 二、登革2型病毒基因組3′非編碼區(qū)對翻譯的調(diào)控作用 利用VIRG系統(tǒng),我們確定了登革病毒3′非編碼區(qū)中RCS2-CS2對翻譯的促進(jìn)、CS1-SL序列對翻譯的抑制作用。完全缺失3′非編碼區(qū)的報(bào)告基因v-3′ΔUTR,幾乎檢測不到VIRG的翻譯信號,說明3′非編碼區(qū)序列參與了報(bào)告基因的翻譯調(diào)控。含有3′非編碼區(qū)VR序列而缺失其余序列的VIRG(v-VR,與含有全長3′非編碼區(qū)的VIRG(v-3′UTR)翻譯效率一致,表明VR序列對于報(bào)告基因的翻譯具有重要作用。由于登革病毒3′末端不含多聚腺苷酸尾,我們設(shè)計(jì)了含有poly(A)尾的報(bào)告基因,發(fā)現(xiàn)VR序列與其翻譯效率相似。說明VR序列可能具有與poly(A)相似的作用,增加mRNA穩(wěn)定性或促進(jìn)核糖體定位。另外,可與5′非編碼區(qū)序列互補(bǔ)發(fā)生環(huán)化的CS1-SL序列比重復(fù)保守序列RCS2-CS2的翻譯效率降低,說明對于基因組復(fù)制至關(guān)重要的環(huán)化序列并非翻譯所必需的,而且mRNA環(huán)化可能阻止了5′末端與核糖體結(jié)合,降低了翻譯效率。 為了進(jìn)一步探討登革病毒3′非編碼區(qū)不同長度序列對翻譯的作用,我們設(shè)計(jì)篩選出5個(gè)在細(xì)胞外可裂解3′非編碼區(qū)RNA的脫氧核酶(DRz),并對其中一個(gè)DRz15進(jìn)行特異性分析。發(fā)現(xiàn)隨時(shí)間延長,靶片段3′非編碼區(qū)RNA逐漸減少而裂解產(chǎn)生的子片段逐漸增多,說明利用脫氧核酶可獲得3′非編碼區(qū)不同長度的序列。在此基礎(chǔ)上,我們研究了在BHK細(xì)胞內(nèi)脫氧核酶裂解報(bào)告基因產(chǎn)生含有3′非編碼區(qū)不同長度序列的VIRG對翻譯的影響,表明在細(xì)胞內(nèi)利用脫氧核酶可獲得含有不同長度3′非編碼區(qū)的報(bào)告基因,為在細(xì)胞內(nèi)登革2型病毒上研究其翻譯調(diào)控提供了可能。最終,利用脫氧核酶在細(xì)胞內(nèi)裂解登革病毒3′非編碼區(qū)產(chǎn)生含有3′非編碼區(qū)不同長度序列的登革病毒基因組,通過觀察基因組翻譯的結(jié)果,明確了其對病毒早期翻譯的影響。這些結(jié)果表明登革病毒3′非編碼區(qū)參與了翻譯過程,而且CS1-SL序列起下調(diào)病毒翻譯效率的作用。 三、登革2型病毒3′非編碼區(qū)不同元件對翻譯的調(diào)控作用 在3′非編碼區(qū)不同長度序列對翻譯具有調(diào)控作用的研究基礎(chǔ)上,我們深入探討了不同元件對翻譯的影響。本研究通過構(gòu)建含有3′非編碼區(qū)不同單一元件的VIRG以及缺失不同元件的VIRG,發(fā)現(xiàn)RCS2、CS2元件具有上調(diào)報(bào)告基因翻譯效率的作用,而CS1、SL元件具有下調(diào)作用。為了排除報(bào)告基因mRNA被降解所造成的差異,我們采用RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR分析了mRNA半衰期,結(jié)果表明翻譯效率的差異與mRNA穩(wěn)定性無關(guān)。對較為重要的SL元件,我們通過堿基突變破壞其二級莖環(huán)結(jié)構(gòu),構(gòu)建了突變體與恢復(fù)突變體VIRG,發(fā)現(xiàn)SL對翻譯效率起下調(diào)作用的關(guān)鍵是其與5′非編碼區(qū)互補(bǔ)的堿基序列,而不是二級莖環(huán)結(jié)構(gòu)。 總之,在病毒非編碼區(qū)誘導(dǎo)的報(bào)告基因VIRG基礎(chǔ)上,我們首次系統(tǒng)地研究了登革2型病毒3′非編碼區(qū)、不同長度序列及不同元件對翻譯的調(diào)控作用。發(fā)現(xiàn)登革病毒3′非編碼區(qū)參與了翻譯調(diào)控, RCS2-CS2序列可提高翻譯效率,而CS1-SL序列可抑制翻譯;RCS2、CS2元件可上調(diào)翻譯,CS1、SL元件可下調(diào)翻譯;SL下調(diào)翻譯的作用與其互補(bǔ)序列有關(guān)。這為闡明3′非編碼區(qū)調(diào)控翻譯的分子機(jī)制奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ),對于研究登革病毒的致病機(jī)制具有重要意義。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R373

【共引文獻(xiàn)】

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1 耿麗卿,秦鄂德,于曼,趙衛(wèi),胡志君,苑錫同,李曉萸,楊佩英;新分離登革2型病毒福建株5′和3′端序列測定及二級結(jié)構(gòu)分析[J];軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊;2000年04期

2 駱建民,王俐,李恩民,金立群,郭光華;加強(qiáng)醫(yī)學(xué)生應(yīng)對突發(fā)公共衛(wèi)生事件能力的培養(yǎng)——“非典”對廣東醫(yī)學(xué)教育的啟迪[J];繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育;2003年05期

3 趙衛(wèi);登革熱減毒活疫苗研究進(jìn)展[J];中國公共衛(wèi)生;2001年07期

4 耿麗卿!100071北京,秦鄂德!100071北京,趙衛(wèi)!100071北京,胡志君!100071北京,苑錫同!100071北京,于曼!100071北京,李曉萸!100071北京,楊佩英!100071北京;新分離登革2型病毒福建株基因組全序列的測定[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;2001年03期

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本文編號：1772094