本文選題：Cpn0810 + THP-1細(xì)胞��； 參考：《南華大學(xué)》2009年碩士論文

【摘要】：目的:構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX6p-2/Cpn0810,在E.coli BL21中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),純化獲得重組融合蛋白Cpn0810。研究該重組蛋白在體外誘導(dǎo)人單核細(xì)胞產(chǎn)生前炎癥細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的水平及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用,為進(jìn)一步探索Cpn感染致病的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法:PCR擴(kuò)增Cpn0810蛋白編碼基因,構(gòu)建pGEX6p-2/Cpn0810重組質(zhì)粒,測序正確后在E.coli BL21中誘導(dǎo)表達(dá),用SDS-PAGE和Western-Blot進(jìn)行分析和鑒定。用ToxinEraser純化柱去除內(nèi)毒素后用不同濃度的GST-Cpn 0810刺激THP-1細(xì)胞;ELISA法檢測經(jīng)刺激后的THP-1細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α和IL-6水平;以WST-1法檢測經(jīng)GST-Cpn0810處理后對THP-1細(xì)胞的增生或抑制作用;用Hoechst33258熒光染色、AnnexinV-FITC-PI染色法檢測細(xì)胞凋亡情況。 結(jié)果:構(gòu)建了重組質(zhì)粒pGEX6p-2/ Cpn0810,并在E.coli BL21菌中高效表達(dá)出Mr約為42kDa的GST-Cpn 0810目的蛋白,超聲裂解后SDS-PAGE分析目的蛋白在菌體細(xì)胞內(nèi)以可溶性形式表達(dá),經(jīng)采用默克Novagen的GST純化樹脂純化獲得純度在95%以上的重組蛋白。GST-Cpn 0810能誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞表達(dá)TNF-α和IL-6,并以時間、劑量依賴方式刺激細(xì)胞分泌前炎癥細(xì)胞因子TNF-α和IL-6,當(dāng)GST- Cpn0810的濃度為4μg/mL時產(chǎn)生的TNF-α和IL-6量最多,分別為(184.75±17.40)pg/mL、(75.36±29.49)pg/mL;當(dāng)GST-Cpn 0810刺激THP-1細(xì)胞24h時產(chǎn)生的TNF-α和IL-6量則達(dá)到高峰。另外GST-Cpn 0810以劑量依賴方式抑制THP-1細(xì)胞增殖。當(dāng)10μg/mL GST-Cpn處理THP-1細(xì)胞24h后,形態(tài)學(xué)上,細(xì)胞表現(xiàn)為皺縮、核碎裂、細(xì)胞起泡及凋亡小體等凋亡特征。 結(jié)論: 1.成功克隆Cpn0810基因并構(gòu)建了pGEX6p-2/ Cpn0810原核表達(dá)載體,將其轉(zhuǎn)化至E.coli BL21后能高效表達(dá)出一相對分子質(zhì)量約42kDa的GST- Cpn0810融合蛋白; 2. Cpn0810蛋白能誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞表達(dá)并分泌前炎癥細(xì)胞因子TNF-α和IL-6; 3. Cpn 0810蛋白既能抑制THP-1細(xì)胞增殖,又能誘導(dǎo)其凋亡。
[Abstract]:Aim: to construct the recombinant plasmid pGEX6p-2 / Cpn0810 and express it in E.coli BL21, and purify the recombinant fusion protein Cpn0810.To study the level of preinflammatory cytokines TNF- 偽 and IL-6 and the role of inducing apoptosis in human monocytes induced by the recombinant protein in vitro, and to provide experimental basis for further exploring the molecular mechanism of Cpn infection.Methods the Cpn0810 protein encoding gene was amplified by 1: -PCR, and the recombinant pGEX6p-2/Cpn0810 plasmid was constructed. The recombinant plasmid was induced and expressed in E.coli BL21 after sequencing correctly, and was analyzed and identified by SDS-PAGE and Western-Blot.The levels of TNF- 偽 and IL-6 produced by stimulated THP-1 cells were detected by Elisa after endotoxin removal by ToxinEraser purification column with different concentrations of GST-Cpn 0810, and the proliferation or inhibition of THP-1 cells was detected by WST-1 method.Apoptosis was detected by Hoechst33258 fluorescence staining and Annexin V-FITC-PI staining.Results: the recombinant plasmid pGEX6p-2/ Cpn0810 was constructed, and the target protein of GST-Cpn 0810, about 42kDa, was highly expressed in E.coli BL21. After ultrasonic lysis, the target protein was expressed in soluble form by SDS-PAGE analysis.Recombinant protein. GST-Cpn 0810 with purity more than 95% was obtained by using GST purified resin of Merck Novagen to induce the expression of TNF- 偽 and IL-6 in THP-1 cells.In a dose-dependent manner, TNF- 偽 and IL-6 were stimulated in a dose-dependent manner. When the concentration of GST- Cpn0810 was 4 渭 g/mL, TNF- 偽 and IL-6 were the highest (184.75 鹵17.40 渭 g/mL), 75.36 鹵29.49 g / mL, respectively, and when GST-Cpn 0810 stimulated THP-1 cells for 24 h, the production of TNF- 偽 and IL-6 reached its peak.In addition, GST-Cpn 0810 inhibited the proliferation of THP-1 cells in a dose-dependent manner.When THP-1 cells were treated with 10 渭 g/mL GST-Cpn for 24 h, the morphological features of the cells were shrinkage, nuclear fragmentation, cell blister and apoptotic bodies.Conclusion:1.The Cpn0810 gene was cloned successfully and the prokaryotic expression vector of pGEX6p-2/ Cpn0810 was constructed. After being transformed into E.coli BL21, a GST- fusion protein with a relative molecular weight of about 42kDa was expressed efficiently.2.Cpn0810 protein can induce the expression and secretion of proinflammatory cytokines TNF- 偽 and IL-6 in THP-1 cells.3.Cpn 0810 protein can not only inhibit the proliferation of THP-1 cells, but also induce its apoptosis.
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R346

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本文編號：1770881