本文選題：SLE + B淋巴細(xì)胞�。� 參考：《復(fù)旦大學(xué)》2009年碩士論文

【摘要】：系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是嚴(yán)重危害人類健康的自身免疫性疾病,其病變特征是患者血清中含有多種致病性的抗核抗體(ANA),以及由此造成的免疫復(fù)合物沉積和最終的多個(gè)靶器官損傷。但是,SLE作為典型的、復(fù)雜的自身免疫性疾病,多年來其病因及發(fā)病機(jī)制并未得到明確結(jié)論,也一直是學(xué)者們研究的熱點(diǎn)。 近幾年來,越來越多的研究提示B淋巴細(xì)胞在SLE發(fā)病過程發(fā)揮重要作用。SLE患者外周血B細(xì)胞表面抑制性受體FcR下調(diào)、B細(xì)胞存活因子BAFF的水平上升,造成患者體內(nèi)B細(xì)胞過強(qiáng)并且持久的活化；MRL/lpr小鼠的狼瘡樣反應(yīng)在B細(xì)胞缺陷時(shí)有明顯緩解；采用去除B細(xì)胞的藥物治療臨床SLE病人取得顯著療效,更是為B細(xì)胞在疾病發(fā)生過程中所起的關(guān)鍵性作用提供了直接證據(jù)。 我們實(shí)驗(yàn)室在長期關(guān)于SLE發(fā)病機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn),活化誘導(dǎo)凋亡的淋巴細(xì)胞來源的DNA(凋亡DNA, apoptotic DNA)免疫同系BALB/c小鼠能誘導(dǎo)高水平抗雙鏈DNA抗體的產(chǎn)生；且抗雙鏈DNA抗體具有致病性,介導(dǎo)免疫小鼠狼瘡腎炎的發(fā)生。而在相同條件下,正常淋巴細(xì)胞來源的DNA(正常DNA, normal DNA)卻不能刺激小鼠產(chǎn)生抗體以及SLE樣自身免疫病發(fā)生。 但是,凋亡DNA如何誘導(dǎo)同系小鼠B細(xì)胞產(chǎn)生抗雙鏈DNA抗體?B細(xì)胞除了具有特異性識(shí)別抗原的BCR,而且表達(dá)Toll樣識(shí)別受體(Toll like receptor),Toll樣識(shí)別受體中的核酸受體如TLR9、TLR7等在自身免疫病中的作用逐漸得到人們重視,如抗體的生成、細(xì)胞的活化以及靶器官的損害等等。那么TLR9是否直接參與了B細(xì)胞抗體的產(chǎn)生呢?而B細(xì)胞除了具有抗體分泌功能,在自身免疫反應(yīng)中的免疫輔助作用也逐漸被重視,研究提示B淋巴細(xì)胞在SLE的發(fā)病中,不僅僅是通過產(chǎn)生多種自身抗體的作用(autoantibody-dependent roles),而且發(fā)揮抗體非依賴的功能(autoantibody independent roles).那么其是否參與凋亡DNA誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞的活化呢?B細(xì)胞同時(shí)具有兩方面作用對(duì)于疾病的發(fā)生有何意義? 基于此,我們首先建立了小鼠SLE樣綜合征模型,在此基礎(chǔ)上深入研究B淋巴細(xì)胞在凋亡DNA致病過程中的作用,為進(jìn)一步理解SLE的發(fā)病機(jī)制提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。 第一部分： B細(xì)胞通過TLR9識(shí)別受體增強(qiáng)凋亡DNA誘導(dǎo)其產(chǎn)生抗雙鏈DNA抗體能力 我們實(shí)驗(yàn)室長期對(duì)SLE發(fā)病機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn),與正常淋巴細(xì)胞來源的DNA(normal DNA)相比,以ConA活化6天后誘導(dǎo)凋亡的的淋巴細(xì)胞來源的DNA(apoptotic DNA)免疫小鼠可誘導(dǎo)SLE樣綜合征。因此,我們以凋亡DNA免疫同系BALB/c小鼠,在其體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生較高水平的抗雙鏈DNA抗體,并成功建立了小鼠SLE樣自身免疫病模型。那么B細(xì)胞作為產(chǎn)生抗雙鏈DNA抗體的唯一細(xì)胞,如何參與抗雙鏈DNA抗體產(chǎn)生,特別是研究TLR9如何直接參與B細(xì)胞在SLE小鼠發(fā)病過程中的作用,成為我們關(guān)注的焦點(diǎn)問題。 因此,我們首先檢測(cè)了各免疫組小鼠脾臟B細(xì)胞的變化,選擇模型抗體誘導(dǎo)生成水平達(dá)到穩(wěn)定的時(shí)間點(diǎn),即免疫后第8周作為觀察的時(shí)間點(diǎn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與正常DNA免疫組相比較,凋亡DNA免疫小鼠脾臟的B細(xì)胞比例和數(shù)量增加；進(jìn)一步分析在凋亡DNA誘導(dǎo)抗體生成過程中B細(xì)胞TLR9的表達(dá)變化發(fā)現(xiàn),凋亡DNA免疫小鼠來源的B細(xì)胞,經(jīng)RT-PCR、Real-time-PCR以及流式方法檢測(cè)后均發(fā)現(xiàn),其Toll樣受體9表達(dá)水平明顯升高；提示B細(xì)胞TLR9可能與其產(chǎn)生抗雙鏈DNA抗體相關(guān)。為此,我們用TLR9信號(hào)通路抑制劑氯喹,聯(lián)合凋亡DNA共同免疫小鼠,發(fā)現(xiàn)體內(nèi)抗雙鏈DNA抗體水平降低；凋亡DNA對(duì)小鼠體內(nèi)B細(xì)胞TLR9的誘導(dǎo)表達(dá)水平降低。考慮到體內(nèi)環(huán)境的復(fù)雜性以及其他表達(dá)TLR9受體細(xì)胞的影響,體外直接觀察B細(xì)胞表達(dá)TLR9對(duì)其生成抗雙鏈DNA抗體的作用。僅凋亡DNA能誘導(dǎo)其免疫小鼠脾臟細(xì)胞在體外產(chǎn)生抗雙鏈DNA抗體,利用這一體外抗體誘導(dǎo)方法,分選凋亡DNA免疫小鼠來源的B細(xì)胞,經(jīng)氯喹預(yù)處理后,再和去除B細(xì)胞的其他同一來源的淋巴細(xì)胞混合,在凋亡DNA體外刺激下觀察抗體的生成。結(jié)果顯示,氯喹單獨(dú)作用B細(xì)胞后,凋亡DNA體外誘導(dǎo)抗體生成能力減弱。 以上結(jié)果提示凋亡DNA可誘導(dǎo)性上調(diào)小鼠B細(xì)胞TLR9表達(dá)水平,B細(xì)胞通過TLR9識(shí)別受體增強(qiáng)凋亡DNA誘導(dǎo)其產(chǎn)生抗雙鏈DNA能力,在SLE的致病過程中有重要意義。 第二部分： B細(xì)胞通過活化CD4+T細(xì)胞形成自我調(diào)節(jié)環(huán)路增強(qiáng)其產(chǎn)生抗雙鏈DNA抗體能力 目前大量的研究提示,B細(xì)胞不僅僅通過分泌自身抗體參與SLE等自身免疫病的發(fā)生,而且在自身抗原提呈、T細(xì)胞的活化和極化以及炎性因子釋放等方面起到重要的抗體非依賴作用。體內(nèi)自身抗體的持續(xù)高水平介導(dǎo)SLE疾病的進(jìn)行性加重,那么B細(xì)胞同時(shí)發(fā)揮抗體非依賴功能,特別是輔助T細(xì)胞活化的作用,形成B細(xì)胞到T細(xì)胞再到B細(xì)胞的自我調(diào)節(jié)環(huán)路,對(duì)于自身抗體的產(chǎn)生和疾病的后續(xù)發(fā)展就更有意義。 為此,我們進(jìn)一步探討凋亡DNA免疫小鼠B細(xì)胞和T細(xì)胞活化的相互作用環(huán)路。我們首先觀察凋亡DNA誘導(dǎo)抗雙鏈DNA抗體產(chǎn)生是否需要T細(xì)胞輔助。結(jié)果表明,凋亡DNA不能誘導(dǎo)裸鼠產(chǎn)生抗雙鏈DNA抗體,去除CD4+T細(xì)胞顯著下調(diào)凋亡DNA體外誘導(dǎo)抗雙鏈DNA抗體的產(chǎn)生,凋亡DNA誘導(dǎo)B細(xì)胞抗體生成是CD4+T細(xì)胞依賴的。進(jìn)一步觀察B細(xì)胞對(duì)凋亡DNA刺激CD4+T細(xì)胞的輔助作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn),經(jīng)凋亡DNA免疫后的B細(xì)胞可以有效輔助CD4+T細(xì)胞的活化增殖,正常DNA免疫小鼠來源的B細(xì)胞不能發(fā)揮這一作用。為進(jìn)一步研究B細(xì)胞輔助CD4+T細(xì)胞的作用機(jī)制,首先用Trans-well實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞主要通過細(xì)胞-細(xì)胞接觸方式活化CD4+T細(xì)胞。APC膜表面共刺激分子包括CD28/B7、CD154/CD40、LFA-1/ICAM-1等是T細(xì)胞活化的重要信號(hào),其中在自身免疫病的研究中提示CD28/B7信號(hào)分子對(duì)T細(xì)胞的反應(yīng)性有重要作用。我們檢測(cè)了B細(xì)胞表面的協(xié)同刺激分子CD80/CD86的表達(dá),發(fā)現(xiàn)經(jīng)凋亡DNA免疫后小鼠B細(xì)胞CD80/CD86表達(dá)上調(diào),而CD86阻斷抗體可以抑制B細(xì)胞對(duì)CD4+T細(xì)胞的活化作用。在第一部分研究中發(fā)現(xiàn),兩種不同來源B細(xì)胞TLR9表達(dá)水平是有差異的,那么TLR9是否參與B細(xì)胞輔助CD4+T細(xì)胞的作用呢?我們觀察用氯喹預(yù)處理B細(xì)胞后對(duì)CD4+T細(xì)胞的活化作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn),氯喹處理組較未處理組B細(xì)胞輔助CD4+T細(xì)胞的作用明顯降低,且氯喹處理組B細(xì)胞CD80/86表達(dá)下降。提示B細(xì)胞經(jīng)凋亡DNA誘導(dǎo)高表達(dá)TLR9的信號(hào)作用,上調(diào)其細(xì)胞表面CD80/86分子,有效輔助CD4+T細(xì)胞活化,進(jìn)而通過活化的CD4+T細(xì)胞形成自我調(diào)節(jié)環(huán)路增強(qiáng)其產(chǎn)生抗雙鏈DNA能力。 綜上所述,我們?cè)诘蛲鯠NA免疫同系小鼠成功建立SLE樣綜合征模型的基礎(chǔ)上,研究提示凋亡DNA誘導(dǎo)小鼠B細(xì)胞TLR9表達(dá)水平升高；B細(xì)胞通過上調(diào)表達(dá)的TLR9信號(hào)作用增強(qiáng)其抗雙鏈DNA抗體生成水平,同時(shí)活化CD4+T細(xì)胞以利于其抗體的持續(xù)產(chǎn)生能力。綜合結(jié)果用示意圖表示如下：
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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1 楊旭燕,魯曉勇,許東航,呂慶華,王巧宏,吳華香;外周血CD_4~+CD_(25)~+T細(xì)胞表達(dá)在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者中的意義[J];中華內(nèi)科雜志;2005年08期

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本文編號(hào)：1766482