本文選題：SLE + B淋巴細胞　； 參考：《復旦大學》2009年碩士論文

【摘要】：系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是嚴重危害人類健康的自身免疫性疾病,其病變特征是患者血清中含有多種致病性的抗核抗體(ANA),以及由此造成的免疫復合物沉積和最終的多個靶器官損傷。但是,SLE作為典型的、復雜的自身免疫性疾病,多年來其病因及發(fā)病機制并未得到明確結論,也一直是學者們研究的熱點。 近幾年來,越來越多的研究提示B淋巴細胞在SLE發(fā)病過程發(fā)揮重要作用。SLE患者外周血B細胞表面抑制性受體FcR下調、B細胞存活因子BAFF的水平上升,造成患者體內(nèi)B細胞過強并且持久的活化；MRL/lpr小鼠的狼瘡樣反應在B細胞缺陷時有明顯緩解；采用去除B細胞的藥物治療臨床SLE病人取得顯著療效,更是為B細胞在疾病發(fā)生過程中所起的關鍵性作用提供了直接證據(jù)。 我們實驗室在長期關于SLE發(fā)病機制的研究中發(fā)現(xiàn),活化誘導凋亡的淋巴細胞來源的DNA(凋亡DNA, apoptotic DNA)免疫同系BALB/c小鼠能誘導高水平抗雙鏈DNA抗體的產(chǎn)生；且抗雙鏈DNA抗體具有致病性,介導免疫小鼠狼瘡腎炎的發(fā)生。而在相同條件下,正常淋巴細胞來源的DNA(正常DNA, normal DNA)卻不能刺激小鼠產(chǎn)生抗體以及SLE樣自身免疫病發(fā)生。 但是,凋亡DNA如何誘導同系小鼠B細胞產(chǎn)生抗雙鏈DNA抗體?B細胞除了具有特異性識別抗原的BCR,而且表達Toll樣識別受體(Toll like receptor),Toll樣識別受體中的核酸受體如TLR9、TLR7等在自身免疫病中的作用逐漸得到人們重視,如抗體的生成、細胞的活化以及靶器官的損害等等。那么TLR9是否直接參與了B細胞抗體的產(chǎn)生呢?而B細胞除了具有抗體分泌功能,在自身免疫反應中的免疫輔助作用也逐漸被重視,研究提示B淋巴細胞在SLE的發(fā)病中,不僅僅是通過產(chǎn)生多種自身抗體的作用(autoantibody-dependent roles),而且發(fā)揮抗體非依賴的功能(autoantibody independent roles).那么其是否參與凋亡DNA誘導CD4+T細胞的活化呢?B細胞同時具有兩方面作用對于疾病的發(fā)生有何意義? 基于此,我們首先建立了小鼠SLE樣綜合征模型,在此基礎上深入研究B淋巴細胞在凋亡DNA致病過程中的作用,為進一步理解SLE的發(fā)病機制提供一定的實驗依據(jù)和理論基礎。 第一部分： B細胞通過TLR9識別受體增強凋亡DNA誘導其產(chǎn)生抗雙鏈DNA抗體能力 我們實驗室長期對SLE發(fā)病機制的研究發(fā)現(xiàn),與正常淋巴細胞來源的DNA(normal DNA)相比,以ConA活化6天后誘導凋亡的的淋巴細胞來源的DNA(apoptotic DNA)免疫小鼠可誘導SLE樣綜合征。因此,我們以凋亡DNA免疫同系BALB/c小鼠,在其體內(nèi)誘導產(chǎn)生較高水平的抗雙鏈DNA抗體,并成功建立了小鼠SLE樣自身免疫病模型。那么B細胞作為產(chǎn)生抗雙鏈DNA抗體的唯一細胞,如何參與抗雙鏈DNA抗體產(chǎn)生,特別是研究TLR9如何直接參與B細胞在SLE小鼠發(fā)病過程中的作用,成為我們關注的焦點問題。 因此,我們首先檢測了各免疫組小鼠脾臟B細胞的變化,選擇模型抗體誘導生成水平達到穩(wěn)定的時間點,即免疫后第8周作為觀察的時間點。結果發(fā)現(xiàn)：與正常DNA免疫組相比較,凋亡DNA免疫小鼠脾臟的B細胞比例和數(shù)量增加；進一步分析在凋亡DNA誘導抗體生成過程中B細胞TLR9的表達變化發(fā)現(xiàn),凋亡DNA免疫小鼠來源的B細胞,經(jīng)RT-PCR、Real-time-PCR以及流式方法檢測后均發(fā)現(xiàn),其Toll樣受體9表達水平明顯升高；提示B細胞TLR9可能與其產(chǎn)生抗雙鏈DNA抗體相關。為此,我們用TLR9信號通路抑制劑氯喹,聯(lián)合凋亡DNA共同免疫小鼠,發(fā)現(xiàn)體內(nèi)抗雙鏈DNA抗體水平降低；凋亡DNA對小鼠體內(nèi)B細胞TLR9的誘導表達水平降低�？紤]到體內(nèi)環(huán)境的復雜性以及其他表達TLR9受體細胞的影響,體外直接觀察B細胞表達TLR9對其生成抗雙鏈DNA抗體的作用。僅凋亡DNA能誘導其免疫小鼠脾臟細胞在體外產(chǎn)生抗雙鏈DNA抗體,利用這一體外抗體誘導方法,分選凋亡DNA免疫小鼠來源的B細胞,經(jīng)氯喹預處理后,再和去除B細胞的其他同一來源的淋巴細胞混合,在凋亡DNA體外刺激下觀察抗體的生成。結果顯示,氯喹單獨作用B細胞后,凋亡DNA體外誘導抗體生成能力減弱。 以上結果提示凋亡DNA可誘導性上調小鼠B細胞TLR9表達水平,B細胞通過TLR9識別受體增強凋亡DNA誘導其產(chǎn)生抗雙鏈DNA能力,在SLE的致病過程中有重要意義。 第二部分： B細胞通過活化CD4+T細胞形成自我調節(jié)環(huán)路增強其產(chǎn)生抗雙鏈DNA抗體能力 目前大量的研究提示,B細胞不僅僅通過分泌自身抗體參與SLE等自身免疫病的發(fā)生,而且在自身抗原提呈、T細胞的活化和極化以及炎性因子釋放等方面起到重要的抗體非依賴作用。體內(nèi)自身抗體的持續(xù)高水平介導SLE疾病的進行性加重,那么B細胞同時發(fā)揮抗體非依賴功能,特別是輔助T細胞活化的作用,形成B細胞到T細胞再到B細胞的自我調節(jié)環(huán)路,對于自身抗體的產(chǎn)生和疾病的后續(xù)發(fā)展就更有意義。 為此,我們進一步探討凋亡DNA免疫小鼠B細胞和T細胞活化的相互作用環(huán)路。我們首先觀察凋亡DNA誘導抗雙鏈DNA抗體產(chǎn)生是否需要T細胞輔助。結果表明,凋亡DNA不能誘導裸鼠產(chǎn)生抗雙鏈DNA抗體,去除CD4+T細胞顯著下調凋亡DNA體外誘導抗雙鏈DNA抗體的產(chǎn)生,凋亡DNA誘導B細胞抗體生成是CD4+T細胞依賴的。進一步觀察B細胞對凋亡DNA刺激CD4+T細胞的輔助作用,結果發(fā)現(xiàn),經(jīng)凋亡DNA免疫后的B細胞可以有效輔助CD4+T細胞的活化增殖,正常DNA免疫小鼠來源的B細胞不能發(fā)揮這一作用。為進一步研究B細胞輔助CD4+T細胞的作用機制,首先用Trans-well實驗發(fā)現(xiàn)B細胞主要通過細胞-細胞接觸方式活化CD4+T細胞。APC膜表面共刺激分子包括CD28/B7、CD154/CD40、LFA-1/ICAM-1等是T細胞活化的重要信號,其中在自身免疫病的研究中提示CD28/B7信號分子對T細胞的反應性有重要作用。我們檢測了B細胞表面的協(xié)同刺激分子CD80/CD86的表達,發(fā)現(xiàn)經(jīng)凋亡DNA免疫后小鼠B細胞CD80/CD86表達上調,而CD86阻斷抗體可以抑制B細胞對CD4+T細胞的活化作用。在第一部分研究中發(fā)現(xiàn),兩種不同來源B細胞TLR9表達水平是有差異的,那么TLR9是否參與B細胞輔助CD4+T細胞的作用呢?我們觀察用氯喹預處理B細胞后對CD4+T細胞的活化作用,結果發(fā)現(xiàn),氯喹處理組較未處理組B細胞輔助CD4+T細胞的作用明顯降低,且氯喹處理組B細胞CD80/86表達下降。提示B細胞經(jīng)凋亡DNA誘導高表達TLR9的信號作用,上調其細胞表面CD80/86分子,有效輔助CD4+T細胞活化,進而通過活化的CD4+T細胞形成自我調節(jié)環(huán)路增強其產(chǎn)生抗雙鏈DNA能力。 綜上所述,我們在凋亡DNA免疫同系小鼠成功建立SLE樣綜合征模型的基礎上,研究提示凋亡DNA誘導小鼠B細胞TLR9表達水平升高；B細胞通過上調表達的TLR9信號作用增強其抗雙鏈DNA抗體生成水平,同時活化CD4+T細胞以利于其抗體的持續(xù)產(chǎn)生能力。綜合結果用示意圖表示如下：
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【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R392

【參考文獻】

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1 楊旭燕,魯曉勇,許東航,呂慶華,王巧宏,吳華香;外周血CD_4~+CD_(25)~+T細胞表達在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者中的意義[J];中華內(nèi)科雜志;2005年08期

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本文編號：1766482