本文選題：DDR2 + 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞��； 參考：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)是現(xiàn)階段研究廣泛的一種重要的成體干細(xì)胞。因其具有良好的生長(zhǎng)、分化能力以及向多種細(xì)胞分化的潛能,成為研究骨再生工程中重要的種子細(xì)胞,它對(duì)骨組織缺損的修復(fù)有著良好的效果。但是BMSCs向成骨細(xì)胞分化并修復(fù)骨組織缺損是一個(gè)復(fù)雜的過程,是由許多細(xì)胞外因子共同作用產(chǎn)生的結(jié)果。近年來的研究證實(shí)DDR2(Discoidin Domain Receptor2)作為I型膠原的特異性受體,在成骨細(xì)胞的分化中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。而對(duì)于其在BMSCs向成骨細(xì)胞的分化過程中所起到的作用還鮮有研究,對(duì)其作用機(jī)理尚不明確。本實(shí)驗(yàn)通過DDR2基因缺失小鼠BMSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定,初步探索DDR2基因缺失對(duì)小鼠BMSCs成骨分化能力的影響,為進(jìn)一步研究BMSCs的成骨分化能力奠定理論基礎(chǔ)。研究?jī)?nèi)容與方法:1.DDR2基因缺失小鼠BMSCs細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定。2.DDR2對(duì)于BMSCs細(xì)胞特異性分化特性的影響作用。3.DDR2基因缺失對(duì)于BMSCs增殖、凋亡、分化的調(diào)控作用。4.DDR2基因缺失對(duì)于BMSCs成骨能力的影響。5.DDR2基因缺失對(duì)BMSCs在動(dòng)物體內(nèi)骨組織修復(fù)能力的影響。我們采用了利用改良型全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)DDR2基因缺失小鼠及野生型小鼠的BMSCs,觀察對(duì)比兩種細(xì)胞形態(tài);流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)兩種細(xì)胞表面標(biāo)記分子的表達(dá);MTT分析檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)周期;流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況,將兩種細(xì)胞進(jìn)行成骨、成脂誘導(dǎo)后,real time-PCR檢測(cè)兩種BMSCs成骨誘導(dǎo)3,7,14天后,其成骨相關(guān)基因的表達(dá)量變化;以及對(duì)成骨分化相關(guān)蛋白的檢測(cè);包括ALP、茜素紅染色及OCN、ALP蛋白定量檢測(cè)。最后采用小鼠顱骨缺損的模型,將BMSCs與支架材料HA/TCP復(fù)合后植入骨缺損區(qū),在成骨6周后進(jìn)行MicroCT掃描及HE染色,觀察DDR2基因缺失對(duì)小鼠成骨能力的影響研究結(jié)果與結(jié)論:1.成功分離培養(yǎng)出DDR2基因缺失小鼠的BMSCs,其生長(zhǎng)狀態(tài)與正常野生小鼠的BMSCs相同,外形均呈長(zhǎng)梭形,可見細(xì)胞成旋渦狀緊密排列生長(zhǎng),其表面標(biāo)記物的表達(dá)符合間充質(zhì)干細(xì)胞的特點(diǎn),細(xì)胞具有體外誘導(dǎo)成骨與成脂分化的能力,證明培養(yǎng)的細(xì)胞是BMSCs。2.DDR2基因缺失后,對(duì)BMSCs的凋亡略有抑制作用,但并不影響其正常的生長(zhǎng)與傳代。3.體外對(duì)兩種BMSCs進(jìn)行成骨和成脂誘導(dǎo)分化后發(fā)現(xiàn),DDR2基因缺失后,BMSCs的成骨分化能力明顯減弱,對(duì)其成脂分化能力略有減弱。4.兩種BMSC s經(jīng)成骨誘導(dǎo)以后,發(fā)現(xiàn)DDR2基因缺失后BMSCs的堿性磷酸酶活性降低,OCN分泌減少,對(duì)其成骨相關(guān)基因的表達(dá)量有明顯的抑制作用。5.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了DDR2基因缺失的BMSCs的骨修復(fù)能力明顯低于正常野生型小鼠的BMSCs。本研究結(jié)果證實(shí)DDR2基因缺失后,對(duì)于BMSCs細(xì)胞形態(tài)特征生長(zhǎng)特性沒有明顯影響。但對(duì)其向成骨細(xì)胞分化有明顯的抑制作用,可以降低細(xì)胞堿性磷酸酶的活性,減少OCN分泌,抑制其成骨相關(guān)基因的表達(dá)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)DDR2基因缺失后,BMSCs修復(fù)骨組織缺損的能力明顯減弱。
[Abstract]:Bone marrow mesenchymal stem cells (Bone Mesenchymal Stem Cells, BMSCs) is an extensive study of adult stem cell. Because of its good growth, differentiation ability and potential of multilineage differentiation, become the important seed cells of bone tissue engineering, bone defect repairing on it have a good effect. But BMSCs osteogenic differentiation and bone defect repair is a complex process that is produced by the interaction of many extracellular factors. Recent studies show that DDR2 (Discoidin Domain Receptor2) is a specific receptor of type I collagen, play an important role in the differentiation osteoblasts. And in the BMSCs to the differentiation of osteoblasts in the role but also little research, the mechanism is not clear. In this experiment, by separating the deletion of DDR2 gene in mouse BMSCs Culture and identification, and to explore the effect of DDR2 gene deletion on osteogenic differentiation of mouse BMSCs, which lays the theoretical foundation for the further study of BMSCs osteogenic differentiation ability. The research contents and methods: isolation of 1.DDR2 gene deletion in mouse BMSCs cells and influence on the differentiation of BMSCs cell specific effects of.3.DDR2 culture and identification of.2.DDR2 gene deletion for the BMSCs proliferation, apoptosis and regulation of.4.DDR2 gene deletion and differentiation for the BMSCs effect of.5.DDR2 gene deletion of BMSCs in the capacity of bone bone in vivo animal repair ability. We adopted the improved method of whole bone marrow adherent cultured DDR2 knockout mice and wild type mice BMSCs, observe and compare the two kinds of cells morphology; flow cytometry. The expression of two cell surface marker detection and analysis of MTT; cell cycle; flow cytometry The apoptosis of two cells osteogenic, adipogenic, real time-PCR detection of two BMSCs 3,7,14 days after osteogenic induction, the expression of bone related genes; and the detection of osteogenic differentiation related protein; including ALP, alizarin red staining and OCN protein, ALP quantitative detection finally. The mouse skull defect model, BMSCs and HA/TCP composite scaffold after implantation of bone defect, MicroCT scan and HE staining in the bone after 6 weeks of observation, to study the influence of DDR2 gene deletion on the osteogenesis of mice and conclusion: 1. successful separation of cultivated DDR2 gene deletion in mice BMSCs, its growth state and wild mice BMSCs same shape were fusiform cells arranged tightly into the whirlpool like growth, the expression of surface markers consistent with the characters of mesenchymal stem cells, cells with in vitro osteogenic and adipogenic differentiation can That is, the cultured cells of BMSCs.2.DDR2 gene deletion, apoptosis of BMSCs was slightly inhibited, but does not affect its normal growth and passage of two kinds of BMSCs.3. in vitro osteogenic and adipogenic differentiation showed that deletion of DDR2 gene, BMSCs osteogenic differentiation ability was significantly weakened, on the differentiation capacity of two kinds of BMSC s.4. decreased after osteogenic induction, alkaline phosphatase activity decreased BMSCs found DDR2 gene deletion, OCN secretion decreased the amount of bone related genes expression inhibition of.5. in vivo was confirmed by bone repair ability of DDR2 gene deletion of BMSCs was significantly lower than that in normal wild in BMSCs. the results of this study confirmed that the DDR2 gene deletion, the growth characteristics of BMSCs cell morphology had no obvious effect. But its to inhibit bone cell differentiation, can reduce the fine The activity of alkaline phosphatase reduces OCN secretion and inhibits the expression of osteogenic related genes. In vivo experiments also confirm that after DDR2 gene deletion, the ability of BMSCs to repair bone defects is significantly reduced.

【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R329.2

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本文編號(hào)：1761927